49±0 45 μmol/L和25 4±1 1pmol/min/mg protein;NC在MDCK-hOCT1/MDCK-hOC

49±0.45 μmol/L和25.4±1.1pmol/min/mg protein;NC在MDCK-hOCT1/MDCK-hOCT3细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC50值分别为0.163±0.027 μmol/L和0.522±0.072 μmol/L。而在mock细胞上IC50值为17.0 ±4.2 μmol/L。OCT1/3抑制剂(+)/(-)-THP均能显著降低NC的细胞毒性;经0.5μmol/L NC处理,MDCK-hOCT1和MDCK-hOCT3细胞存活率分别降低至空白对照组的17.5±4.7%和55.4±3.8%,50μmol/L的(+)/(-)-THP使MDCK-hOCT1细胞存活率分别升高至对照组的45.6±1.2%和51.6±2%,使MDCK-hOCT3细胞存活率升高至对照组的89.1±5.3%和86.1±7.0%。在大鼠原代肝细胞模型上也观察到(+)/(-)-THP对NC诱发的肝细胞毒性的减弱作用。NC在MDCK-hMATE1细胞上的积聚显著高于mock细胞,其Km、Vmax及Clint分别为0.897±0.085 因为 nmol/L,18.5±1.0 pmol/mg protein/min,为20.6mL/mg protein/min。然而,MATE1对NC的转运能力(Clint:20.6 mL/mg protein/min)明显低于OCT1(Clint:311 mL/mg protein/min)。结论:OCT1,OCT3通过介导NC的细胞摄取,在其致肝细胞毒性中发挥重要作用;(+)/(-)-THP通过抑制OCT1,OCT3介导的细胞摄取而减弱NC的肝细胞毒性。MATE1对NC的转运能力低于OCT1,推测肝细胞中由hOCT1和hOCT3介导的NC摄取大于hMATE1介导的外排。第三章CYP450对Nitidine的代谢解毒作用背景和目的:第二章实验结果显示,NC在大鼠原代肝细胞上的毒性明显低于稳定高表达OCTs的MDCK细胞上的毒性,我们推测原代肝细胞中OCTs表达可能低于稳定转染细胞,推测原代肝细胞中P450酶(CYP450)可能介导NC代谢,从而降低NC的细胞毒性。因此,本章研究CYP酶对NC的代谢及在其肝细胞毒性中的作用。方法:应用人肝微粒体代谢酶表征实验和人重组酶验证,阐明参与NC肝脏代谢的主要CYP酶亚型;比较NC对MDCK-hOCT1细胞及hOCT1与hCYP3A4双转细胞(MDCK-hOCT1/hCYP3A4)的毒性差异,以及CYP3A4抑制剂对NC致MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞毒性的影响,阐明CYP酶对NC的代谢解毒作用。结果:CYP3A4, Pifithrin-α半抑制浓度 CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的肝脏代谢。NC (0.25-10 μmol/L)对MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞的毒性明显低于对MDCK-hOCT1细胞的毒性;CYP3A4抑制剂,氟康唑和红霉素,显著增强NC在MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞上的毒性,提示CYP3A4通过介导NC代谢而减弱NC的毒性。结论:肝脏CYP3A4, CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的一相代谢;CYPs,如CYP3A4,可通过介导NC的肝脏代谢而降低其肝细胞毒性。第四章Nitidine在大鼠体内的药动学和组织分布研究背景和目的:前述研究考察NC在转基因细胞模型及原代肝细胞模型上的摄取及细胞毒性,本章主要考察单次口服和尾静脉注射后,NC在大鼠体内的药动学过程,并计算其口服生物利用度,以推测口服给予NC后在体内是否会引起毒性。同时考察单次及连续20天静脉注射NC (5mg/kg)后,其在大鼠体内的组织分布,以阐明NC分布的组织特异性及连续给药可能由OCTs介导NC细胞摄取发生的组织蓄积现象,为NC的体内毒性提供药动学依据。方法:建立快速、准确、灵敏的LC-MS/MS法测定生物样本中的NC,并将此方法用于测定大鼠口服10mg/kg或尾静脉注射2 mg/kgNC后的血浆药物浓度,计算其口服生物利用度;比较单次静脉注射5 mg/kg NC与相同剂量连续给药20天后相应组织的分布差异。结果:大鼠口服10 mg/kg NC后,血药浓度低,其绝对生物利用度仅为4.8%。鉴于口服NC的生物利用度低,本章考察了大鼠单次静脉注射5 mg/kg NC后的组织分布,结果显示,给药后0.25 h、0.5 h及2h,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度远远高于其在血浆中的浓度,组织与血浆的浓度比值为9.2-2852;以5mg/kg/day的剂量连续静注20天,末次给药后2h,心脏、肝脏、肾脏及小肠中NC的浓度均高于单次给药后相应组织中的浓度。结论:NC的口服生物利用度低,推测其口服后产生毒性的可能性较小。单次静脉注射NC后,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度高于其在血浆中的浓度。因此,推测大鼠连续静注NC,可能会产生组织蓄积而引起一定的毒性。第五章Nitidine连续给药后大鼠体内的毒性研究背景和目的:前几章研究显示,由于肝脏细胞中OCT1/3介导NC的细胞摄取,导致NC较强的肝细胞毒性。但NC经口给药后绝对生物利用度低,而静脉注射后组织分布研究表明,NC在不少组织中的浓度显著高于血浆中浓度,且连续给药后,在大鼠肝脏、肾脏及心脏等脏器存在蓄积现象,提示连续给药NC在大鼠体内可能引起脏器毒性或整体毒性。因此,本章考察大鼠连续静脉注射NC后的毒性,为NC的研发提供参考。方法:Sprague-Dawley大鼠连续20天静脉注射5 有 mg/kg/day NC,观察其一般活动行为、体重、检测血清生化指标,组织病理学检查,综合评价NC在体内的整体毒性。以MDCK-hOCT2和mock细胞为模型,采用MTT法及检测细胞培养液中LDH活性的方法,对hOCT2介导的NC细胞毒性以及OCT2抑制剂,(+)/(-)-THP和西咪替丁,对其细胞毒性的减弱作用进行考察。结果:NC可引起大鼠食欲减退,体重减轻,血清LDH值和BUN值明显升高,分别为给药前的2.1倍和1.4倍,ALP值显著降低至给药前的1/5,且组织病理学检查观察到肾小管产生空泡变性,未发现NC在大鼠体内对其它受检脏器引起毒性。此外,NC在MDCK-hOCT2细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC5o值分别为0.556±0.083 μmol/L及17.0 ±4.

01),提示染铅组大鼠体内~(45)Ca~(2+)摄入远低于对照组。各组大鼠骨钙含量比较结果为:对照组>高钙铅处理组>铅处理组>低

01),提示染铅组大鼠体内~(45)Ca~(2+)摄入远低于对照组。各组大鼠骨钙含量比较结果为:对照组>高钙铅处理组>铅处理组>低钙铅处理组,而大鼠骨骼中铅含量结果则与之相反,雌雄均呈类似趋势。铅处理组和低钙铅处理组雄性大鼠骨铅水平相近,其余组间骨钙和骨铅差异显著(p<0.05),统计分析发现二者呈直线负相关。激光共聚焦扫描电镜观察Fluo-3/AM分子探针标记的成骨细胞内Ca~(2+)荧光时发现,胞内游离Ca~(2+)浓度在铅作用下升高。证实铅对体内外钙的吸收均有着显著的抑制作用。 为什么 5.大鼠血液OC值在对照组中最大,其次为高钙铅处理组,铅处理组列第三,均高于低钙铅处理组,组间差异明显。雌雄类似,但雄性中尤其明显。与之相反的是,大鼠血液PTH含量则表现为低钙铅处理组中最高,其次为铅处理组、高钙铅处理组和对照组。除雄性大鼠铅处理和高钙铅处理组外,其余大鼠各组间PTH含量差异极显著。统计分析结果显示,大鼠OC和PTH之间并不存在直线负相关;但作散点图分析发现,OC和PTH之间存在负相关的趋势。PTHr1在低钙铅处理组中高表达,而在对照组中低表达,高钙铅处理组表达量高于对照组但低于铅处理组。OC的表达趋势与PTHr1相反,对照组和高钙铅处理组中OC高表达,低钙铅处理组中表达量极少,铅处理组表达则稍多于低钙铅处理组。结果表明铅影响了大鼠体内骨相关蛋白及其受体的表达。 6.大鼠股骨OB及UMR106细胞电镜超微结构显示,铅使两类细胞结构不同程度改变,尤其是线粒体和粗面型内质网的结构变化较大,但对于细胞膜系统的损伤则仅在高浓度时出现。结果表明铅损伤了成骨细胞的结构。 7.铅使UMR106细胞贴壁性下降,OB的形态发生改变。OB和UMR106细胞ALP、CollagenⅠ随铅浓度的增加而表达减少,提示铅影响了成骨细胞的形态及标志物的表达;铅降低了成骨细胞OC的分泌,并使OC的调节因子如bFGF、cbfa1/osf2、c-fos和c-jun的表达减少;铅明显促进p-ERK1/2的表达,ERK1/2途径的特异性阻断剂PD98059可使铅对UMR106的这种作用减弱或消失,但对于总ERK1/2的表达并无影响。表明MAPK(ERK1/2)信号转导转导途径可能参与了铅对成骨细胞毒性作用的调控。 Lonafarnib体外 综上所述,铅抑制了骨骼的正常生长发育,低钙处理加剧了其作用,而适量的钙补充有利于减轻铅对于骨骼生长的抑制作用。铅对于骨骼生长发育的毒性与铅干扰机体钙的吸收和利用,以及与铅对OC表达的直接或间接影响相关,其中可能有ERK1/2信号转导途径的参与。原发性支气管肺癌(简称肺癌),是最常见的肺部原发性恶性肿瘤。世界上至少有35个国家的男性肺癌在各种癌症死因中占第一位,女性中死于肺癌的患者也仅次于乳腺癌的死亡人数。研究表明组蛋白的乙酰化状态对参与细胞增殖和分化的基因表达具有重要调控作用,因此,基于组蛋白乙酰化的治疗策略逐渐引起重视。本文主要研究了组蛋白去乙酰基酶(histone deacetylases,HDAC)抑制剂(histone deacetylases inhibitor,HDACI)TSA(Trichostatin A)对肺腺癌细胞A549的生命活动包括细胞周期及凋亡的影响,并且对特异Ⅱ型肺细胞标志——muc1基因和细胞周期调节因子cdc2基因启动子区的染色质重塑机制以及转录相关因子的结合进行了研究,为非小细胞肺癌的临床治疗提供一定的理论依据。 一、TSA对肺腺癌细胞A549的细胞周期及凋亡的影响 1.TSA对肺腺癌细胞A549的细胞周期的影响 400nM TSA处理A549后,进行流式细胞仪检测结果显示:TSA可以引起A549细胞周期在G1期和G2/M期产生阻滞,以G2/M期阻滞更为显著。同时发现TSA也抑制G2/M期细胞周期相关因子cdc2,cdc25c以及cyclinB2的mRNA的表达,促进G1期细胞周期相关因子p21 mRNA的表达。 2.TSA对肺腺癌细胞A549凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示400nM TSA处理16小时起A549细胞开始出现凋亡,随着TSA处理时间的延长,凋亡程度逐渐加重;同时western blotting结果显示400nM TSA处理16小时起,PARP开始出现断裂,随着时间的延长PARP断裂程度逐渐加重。 二、TSA与p53对muc1基因及cdc2基因启动子活性的影响 1.TSA对muc1基因及cdc2基因启动子活性的影响:构建带有人2.4kb的muc1基因上游调控区序列以及cdc2基因启动子区的-758/+61的CAT报告基因质粒pREP4m-muc1-2.4k与pREP4m-cdc2-CAT。将含有报告基因表达质粒pREP4m-muc1-2.4k和pREP4m-cdc2-CAT以及内参照质粒pM-CAT瞬时共转染A549细胞之后加入TSA进行诱导处理,启动子活性分析结果表明:TSA可以抑制muc1和cdc2基因的启动子活性。将muc1基因上游调控区进行删切,构建不同长度(4k、1.6k、298bp、724bp)启动子序列驱动的报告基因质粒,启动子活性分析结果表明:TSA对muc1基因转录活性的抑制可能通过muc1基因启动子区-724上游的调控区介导。 寻找更多 2.p53对muc1基因及cdc2基因启动子活性的影响:p53表达质粒与pREP4m-muc1-2.4k和pREP4m-cdc2-CAT以及pM-CAT瞬时共转染A549细胞,启动子活性分析结果表明,p53可以降低muc1基因和cdc2的启动子活性,突变的p53表达质粒可以减弱这种抑制作用,TSA处理可以加强p53对muc1基因的抑制,同时western blotting结果显示TSA处理可以促进p53的表达,提示TSA可能通过p53间接调节muc1基因的表达。将muc1基因上游调控区的两个CCAAT盒以及一个潜在的p53半位点分别进行突变后与pM-CAT瞬时共转染A549细胞,启动子活性分析结果显示,潜在的p53半位点突变后p53抑制muc1基因启动子区活性的作用急剧减弱。这些结果提示,p53可能通过p53结合位点发挥对muc1基因的调节作用。 三、TSA对染色质重塑蛋白及修饰因子对muc1基因启动子活性的影响 1.PCAF与p300对muc1基因启动子活性的影响:PCAF表达质粒或p300表达质粒与pREP4m-muc1-2.4k和pM-CAT瞬时共转染A549细胞,启动子活性分析结果表明,PCAF和p300可以增强muc1基因启动子的活性。 2.BRG1与BRM对muc1基因启动子活性的影响:BRG1表达质粒(或其显性负突变体)与pREP4m-muc1-2.4k和pM-CAT瞬时共转染A549细胞后,启动子活性分析结果表明,BRG1表达质粒抑制muc1基因启动子的活性;BRM表达质粒(或其显性负突变体)与pREP4m-muc1-2.

体外原代培养的HUVECs,分为对照组和Notch信号阻断组,利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术,检测细胞内ROS水平。

体外原代培养的HUVECs,分为对照组和Notch信号阻断组,利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术,检测细胞内ROS水平。分别在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧(ROS)水平,并使用相关的抑制剂作用血管内皮细胞确定生理状况下,ROS的主要来源。 3.体外培养人原代HUVECs被分为六组:对照组(DMSO组),单纯Notch阻断组(GSI组),Notch阻断加NADPH氧化酶阻断组(GSI+DPI),Notch阻断加抗氧化剂组(GSI+NAC),单纯NADPH氧化酶阻断组(DPI)和单纯抗氧化剂组(NAC)。刺激后分别用MTT法检测细胞增殖;划痕法检测细胞迁移;结晶紫染色检测细胞黏附;细胞外基质胶(Matrigel)检测管腔形成。 4.体外原代培养的HUVECs,分为照组和Notch信号阻断组,经刺激48h,RIPA裂解收取蛋白,定量并变性后,蛋白印记法(Western-Blots)检测HUVECs相关蛋白表达水平变化。 【结果】 1.采用改良体外培养HUVECs培养方法,获得大量稳定血管内皮细胞,应用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基(ECM)培养细胞,MTT法观察细胞生长曲线表明:细胞生长旺盛2-3d生长最快,4-6d可融合。利用流式细胞技术进行APC-CD31细胞Marker以及免疫组织化学进行Ⅷ因子染色鉴定,血管内皮细胞的纯度高达99.56%。 Ipatasertib核磁共振 2.体外原代培养的HUVECs,经GSI阻断Notch信号后,利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术,结果表明:在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧(ROS)水平明显升高。随后使用相关的抑制剂作用血管内皮细胞后,利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术,结果发现:生理状况下,ROS的主要来源于细胞膜上的NADPH氧化酶。 3.体外培养的HUVECs,各组经刺激后分别用MTT法检测细胞增殖、划痕法检测细胞迁移、检测黏附及体外管腔形成。结果显示:阻断Notch信号通路后,HUVECs增殖明显增加;细胞迁移速度加快;黏附以及管腔生成增加;利用ROS清除剂以及NOX抑制剂后,细胞增殖明显减慢;划痕法检测细胞迁移;细胞迁移,黏附及管腔形成实验均得到相似结果。 4.体外原代培养的HUVECs经GSI阻断Notch信号48h后,蛋白印记法(Western-Blots)检测HUVECs相关蛋白结果显示:阻断Notch后,NOX4蛋白含量明显增加;VEGFR2,P38及ERK的磷酸化水平增加;SOD1蛋白水平未见明显变化。 【结论】 1.采用改良外培养HUVECs培养方法,获得大量稳定高纯度的HUVECs,为后续实验提供充足的细胞来源。 2.体外培养HUVECs,经GSI阻断Notch信号后,在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧(ROS)水平明显升高;使用相关的抑制剂后,证实血管内皮细胞内ROS的主要来源来细胞膜上的NADPH氧化酶。 3.体外培养HUVECs,经GSI阻断Notch信号及各组经刺激后, HUVECs细胞增殖、迁移、黏附及管腔生成明显增加;利用ROS清除剂以及NOX抑制剂后,细胞增殖明显减慢;划痕法检测细胞迁移;细胞迁移,黏附及管腔形成实验均得到相似结果,说明Notch信号时通过调细胞内ROS的水平来影响血管内皮细胞生物学行为。 此网站 4.体外原代培养的HUVECs经GSI阻断Notch信号48h后,Western-Blots结果显示:HUVECs经GSI阻断Notch信号后,ROS水平增加是NOX4蛋白激活引起其产生增多而非SOD1对其清除减少引起的;增加的ROS通过引起下游VEGFR2,P38及ERK的磷酸化水平增加而引起下游一系列信号反应。目的: 肝纤维化是多种慢性肝脏病变最终进展到肝硬化的一个重要中间过程,以肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化和细胞外基质(extracel lular matrix,ECM)的大量沉积为主要特征。研究证实,Wnt信号通路在肝纤维化的过程当中起到了重要的作用,其中以Wnt/β-catenin研究的最多。中药肝复康是我校病理生理教研室经多年实验总结出的抗肝纤维化的经验方,已证实对Wnt/β-catenin通路和非经典的Wnt/Ca2+信号通路均有抑制作用。目前,在对肿瘤一些的研究中发现,Wnt/Ca2+信号通路能够对Wnt/β-catenin通路起到抑制的作用,即说明了这两条通路在有些肿瘤中并不是单一的产生作用,而两条通路之间也是可能存在某种相互关系,能够相互影响,但在对肝纤维化的研究中则主要研究的是每条通路与肝纤维化的发生发展可能存在的某些机制,但对这两条通路之间的相互关系却还不十分明确。SB216763是GSK-3β的抑制剂,使胞浆中β-catenin大量累积并入核,从而激活Wnt/β-catenin通路。本实验通过使用中药肝复康药物血清和SB216763干预培养的HSC,然后分析在肝纤维化发生发展过程中Wnt/β-catenin通路与Wnt/Ca2+信号通路之间的相互关系。 获悉更多 方法: 用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5%CO2混合气体、37℃的孵箱中培养,传代大鼠HSC-T6细胞株。待细胞条件成熟后,再用不含血清的DMEM培养基饥饿培养24h后分组加药。 在六孔板中将细胞随机的分为以下五组:正常血清组(含10%正常大鼠血清的DMEM培养基);SB21676320μM组(含10%正常大鼠血清,SB2167632umol/L的DMEM培养基);SB21676310μM组(含10%正常大鼠血清,SB2167631umol/L的DMEM培养基):肝复康治疗组(含10%肝复康治疗组大鼠血清的DMEM培养基);SB21676320μM加肝复康治疗组(SB21676320μM基础上用10%肝复康药物血清干预),用孵箱在37℃,5%CO2混合气体的环境中培养48h。 逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测HSC细胞中collagen I,collagen Ⅲ,a-SMA的表达和Wnt/Ca2+信号通路中的相关指标Wnt5a, Frizzled2,CAMKII, MPP-7mRNA相对表达量,免疫蛋白印迹法(western blot)检测细胞中MPP-7的蛋白表达量。实验结果均采用SPSS13.0统计软件分析。 结果: 1、SB216763与肝复康对大鼠HSC-T6细胞活性及a-SMA、I型、III型胶原的影响 1.1RT-PCR检测SB216763对大鼠HSC-T6细胞活性及a-SMA、I型、III型胶原的影响 SB21676310μM与SB21676320μM组HSC明显活化, I型胶原、…
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25%胰酶消化,以3000/孔接种于6孔板中,培养10天至两周。再进行HE染色检测细胞克隆存活。 7 siRNA沉默自噬关键基因A

25%胰酶消化,以3000/孔接种于6孔板中,培养10天至两周。再进行HE染色检测细胞克隆存活。 7.siRNA沉默自噬关键基因Atg5和Atg7 取对数生长期耐药食管癌细胞EC109/CDDP,以1×105、孔接种于6孔板中,转染时细胞要达到90~95%的融合,培养24h,吸弃培养基,细胞换成在含血清和双抗的正常培养基中,每孔2ml培养基,放入培养箱中培养,等待转染。配制溶液A:每100μl培养基中含有150ng Atg5siRNA或Atg7siRNA,在溶液A中加入转染试剂12μ1/孔,加入的时候要小心滴入,并轻轻摇使溶液混合均匀,室温中放置10min。每孔100μl轻轻加入6孔板中,待6孔板都加完后,画十字的轻轻晃动平移6孔板使溶液混合均匀。放入培养箱中培养48h。48h后采用western blot方法检测Atg5或Atg7确定敲除效果。之后同样操作转染步骤,转染48h后加入顺铂2.5μM处理48h,用0.25%胰酶消化,以3000/孔接种于6孔板中,培养10天,再进行HE染色,观察克隆存活情况。8.流式细胞术检测顺铂对敏感细胞和耐药细胞凋亡的影响 取对数生长期EC109和EC109/CDDP细胞,以3×105/well接种于60mm培养皿中,培养24h,吸弃培养基,加入顺铂2.5μM处理细胞48h,撤去药物,分别1天,2天和4天后收集细胞,用不含EDTA Trypsin消化,2ml/well,消化时间要短,注意观察,一消化下来就马上用全培终止消化,收集在15ml离心管中,800rpm,5min;用PBS洗两遍,第一遍PBS的量2ml/Tube,800rpm,5min;第二遍PBS的量2ml/Tube,并转移至流式管,800rpm,5min;倒掉上清液,用滤纸倒靠滤干;配制1xBinging Buffer,以100μl/Tube加入流式管中悬浮细胞,加入PI2.5μl/Tube, GSK1120212小白鼠 FITC2.5μl/Tube;室温放置10min;最后以400μl/Tube加入1xBinging Buffer,流式机上样检测。 9.p-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性分析U0126对顺铂促衰老作用的影响 取对数生长期EC109和EC109/CDDP细胞,以1×105/well接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入顺铂2.5μM处理细胞48h,撤去药物,分别1天,2天和4天后吸弃培养基,每个孔用1ml PBS各洗两次,小心吸取防止细胞掉落,每个孔加入1.5ml1×Fixation Buffer室温中放置6-7分钟,在固定的这段时间内配制Staining Mixture,固定后每个孔用1ml PBS各洗三次后,加入新鲜配制好的Staining Mixture染液中,37℃孵育过夜,显微镜下观察细胞蓝染细胞数目。每种细胞计数四个视野,每个视野至少100个细胞,计算细胞染色阳性率。 为了研究联用U0126后对顺铂诱导食管癌细胞衰老的影响,取对数生长期EC109和EC109/CDDP细胞,以1×105/well接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入顺铂2.5μM, U0126和顺铂2.5gM联用U0126处理细胞48h,撤去药物,吸弃培养基,按上述步骤检测食管癌细胞衰老情况。 10.MAPKs和mTORC1通路活性的检测 药物处理细胞后,收集细胞并提取总蛋白。分别使用抗ERK1/2, phosphor-ERK1/2, p38, phosphor-p38, AZD2281分子重量 JNK, phosphor-JNK的单克隆抗体(cell signaling卫生),采用western blot的方法,检测蛋白的磷酸化来反应通路的激活或抑制。 mTORC1下游有两个关键的底物70kDa核糖体蛋白S6激酶(70kDa S6Kinase, S6K)和真核翻译起始因子4E(eIF4E)结合蛋白1(eukaryotic translational initiation factor4E-binding protein1,4E-BP1)。活化的mTORC1磷酸化激活S6K,磷酸化4E-BP1可以解除对eIF4E的抑制。这两者的磷酸化程度同mTORC1活性正相关。此外,mTOR在Ser2481位点上会自我磷酸化。当mTORC1活性增强时,该位点上的磷酸化也会增强。因此,我们可以通过检测S6K,4E-BP1和mTOR的磷酸化来显示mTORC1的活性。具体方法为:药物处理细胞后,收集细胞并提取总蛋白。采用western blot的方法,检测mTOR,phospho-mTOR(ser2481), S6K, phosphor-S6K,4E-BP1和phospho-4E-BP1的表达。…
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假手术重组人生长激素治疗组(G8O);7天,n=12,共80只 制作阻塞性黄疸大鼠模型。术后rhGH组及GSO组行双后肢内侧轮流皮

假手术重组人生长激素治疗组(G8O);7天,n=12,共80只.制作阻塞性黄疸大鼠模型。术后rhGH组及GSO组行双后肢内侧轮流皮下注射重组人生长激素(0.75iu/kg/d)。术后7天、14天采集大鼠血液、取回肠末端小肠组织。大鼠血液检测肝功能。小肠组织HE染色观察黏膜病理形态学改变,免疫组织化学检测肠黏膜紧密连接蛋白claudin-1及MEK2含量。 ROCK抑制剂 结果:1)rhGH组、OJ组与SO组比较,血TB、DB和ALT值增高(P0.05有统计学意义)、t检验、方差分析(Analysis of variance,ANOVA)和LSD法、因素相关性使用直线相关分析、各临床资料相关性使用X2检验,P

2倍,1 h后几乎恢复到正常水平。 2 JNK特异性抑制剂SP-600125呈剂量依赖性的方式抑制AngⅡ诱导的JNK活化和c-J

2倍,1 h后几乎恢复到正常水平。 2.JNK特异性抑制剂SP-600125呈剂量依赖性的方式抑制AngⅡ诱导的JNK活化和c-Jun磷酸化,当浓度为10μmol/L和20μmol/L时其抑制作用分别达75%和90%,SP-600125对ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平均无抑制作用。 3.AngⅡ刺激后c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性显著增加,SP-600125可呈剂量依赖的抑制AngⅡ诱导的c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性的增加,20μmol/L SP-600125预处理几乎完全阻断c-Jun的反式激活。4.AngⅡ显著增加MCP-1启动子活性及MCP-1 mRNA表达,SP-600125可呈剂量依赖性的抑制AngⅡ诱导的MCP-1启动子活化和MCP-1 mRNA表达以及系膜细胞MCP-1、TGF-β和FN的分泌。5.1~20μmol/L SP-600125以剂量依赖的方式抑制AngⅡ促进的系膜细胞~3H-TdR掺入量和细胞计数的增加,而MEK1/2特异性抑制剂PD-98059和p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580对AngⅡ诱导的系膜细胞数目的增加无抑制作用。 结论:AngⅡ→JNK/SAPK→c-Jun/AP-1信号通路在系膜细胞增殖和炎症介质分泌中发挥一定的作用。JNK特异性抑制剂SP-600125能部分抑制AngⅡ诱导的系膜细胞增殖和炎症介质分泌。 二、血管紧张素Ⅱ通过ROS/EGFR/JNK/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖 目的:我们前期的研究发现AngⅡ可通过JNK/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖,但JNK/AP-1活化的上游通路尚不清楚。本研究探讨活性氧(ROS)和表皮生长因子受体(EGFR)在AngⅡ诱导的JNK/AP-1活化及系膜细胞增殖中的作用并探讨ROS释放的来源。 Metformin 方法:体外培养人肾小球系膜细胞,应用~3H-TdR掺入法和细胞计数测定系膜细胞增殖;荧光探针2,7—二氯二氢荧光素乙酰乙酸(DCFDA)检测细胞内ROS产生;化学发光法检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性;实时定量RT-PCR检测NADPH亚基p47phox和p67phox mRNA表达;Western Blot检测p47phox和p67phox膜转位以及EGFR、JNK和c-Jun磷酸化。 Tofacitinib数据表 结果:1、AngⅡ呈时间依赖性和剂量依赖性促进肾小球系膜细胞ROS产生。AngⅡ刺激3 min,系膜细胞内ROS产生明显增加,至60 min达到高峰,系膜细胞ROS产生是对照组2.26倍;1、10、100nmol/L AngⅡ刺激60 min,ROS产生分别是对照组的1.82、2.92和4.08倍。AT1受体(AT1R)拮抗剂losartan完全阻断了AngⅡ诱导的ROS产生,而AT2受体(AT2R)拮抗剂PD123319无抑制作用。2、NADPH氧化酶抑制剂apocynin和DPI几乎完全阻断AngⅡ诱导的ROS产生,而线粒体complexⅠ抑制剂鱼藤酮(rotenone,ROT)、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇(allopurinol,ALLO)、环氧化酶抑制剂吲哚美辛(indomethacin,INDO)、脂氧化酶抑制剂(nordihydroguiaretic acid,NDGA)、细胞色素P450氧化酶抑制剂酮康唑(ketoconazole,KETO)以及一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-甲酯精氨酸(N~G-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)对AngⅡ诱导的ROS产生均无明显影响。AngⅡ显著刺激NADPH氧化酶活化及p47phox和p67phox膜转位。3、AngⅡ可呈时间依赖性和剂量依赖性诱导系膜细胞EGFR磷酸化,100 nmol/L AngⅡ刺激30 min,EGFR磷酸化达到高峰,是对照组的3.96倍;AT1受体阻断剂losartan、抗氧化剂乙酰半胱氨酸(NAC)以及NADPH氧化酶抑制剂apocynin和DPI显著抑制AngⅡ诱导的EGFR磷酸化,同时EGFR拮抗剂AG-1478几乎完全阻断AngⅡ诱导的系膜细胞增殖。4、Losartan、NAC、apocynin、DPI和AG-1478阻断AngⅡ诱导的JNK/AP-1活化和系膜细胞增殖。 结论:ROS/EGFR/JNK/AP-1信号通路参与AngⅡ诱导的肾小球系膜细胞增殖。NADPH氧化酶抑制剂和EGFR受体拮抗剂能显著抑制AngⅡ诱导的系膜细胞增殖,可能具有一定的治疗作用。 selleck化学药品液面控制 本研究创新之处在於: 1.首次发现:AngⅡ可通过JNK—c-Jun/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖和MCP-1、TGF-β以及FN表达(参见:Zhang A,Ding G,Huang S,Wu Y,Pan X,Guan…
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05。(3)GCSsiRNA转染K562∕A02细胞24小时后,以Mock组为对照、GAPDH基因为内标,实验组GCS mRNA表

05。(3)GCSsiRNA转染K562∕A02细胞24小时后,以Mock组为对照、GAPDH基因为内标,实验组GCS mRNA表达水平明显受抑制,抑制率为69%(58~78% ), P 0.05。与GCSsiRNA转染K562/A02细胞24小时比较,转染48小时后MDR1mRNA表达下调65%(54~74%),P AUY-922分子量 0.05。(4)与K562/A02细胞空白组比较,转染72小时后GCSsiRNA组和MDR1siRNA组细胞P-gp表达的相对吸光度值分别下调1.44倍和3.54倍, P目的探讨IL-29和IL-10单独和联合脂多糖刺激Hela细胞后IL-15和IL-6转录水平的变化,分析其激活的信号转导通路。 方法培养的Hela细胞,经不同浓度的LPS及IL-10(IL-29)单独或联合处理后,提取细胞总RNA和总蛋白,RT-PCR分析IL-15和IL-6转录水平的变化,Western blot分析信号转导通路蛋白变化。 结果1. RT-PCR分析显示: ①1 ng~10μg LPS刺激Hela细胞12 h后,IL-15mRNA和IL-6mRNA水平均明显上调(与对照组比较:P0.05)。不同浓度的IL-10(1,10,100 ng/mL)均下调100 ng/mL LPS诱导的Hela细胞IL-15mRNA和IL-6mRNA的表达,且浓度越高IL-10抑制作用越明显。 ③单独IL-29(100ng/ml)作用能显著降低Hela细胞IL-15和IL-6转录水平。IL-29和LPS联合作用Hela细胞后,IL-29亦能显著抑制LPS诱导的IL-15和IL-6转录,并且在一定浓度范围内(80~240ng/ml)存在剂量依赖性(与LPS组比较,P0.05)。 结论IL-10和IL-29均能抑制LPS诱导的炎症细胞因子IL-15和IL-6的转录,且发现IL-10下调作用可能与其能阻断AKT的激活有关。因而,我们推测IL-29可能具有类似IL-10的抗炎作用,为某些临床感染性疾病的预防和治疗带来新的希望。为了研究氧化应激影响肉仔鸡肉品质的主要MAPK信号转导通路,论文分为肉仔鸡胸肌骨骼肌卫星细胞氧化应激模型优化,氧化应激状态下起主要作用的MAPK信号通路的筛选,抗氧化物质对信号通路的作用及维生素C和茶多酚对慢性应激条件下肉仔鸡生产性能的影响及其MAPK通路四个部分,采用细胞模型和动物应激试验相结合的方法,研究了氧化应激时MAPK信号通路的改变对鸡肉品质的影响机理。现分别摘要如下: 试验一肉仔鸡胸肌卫星细胞氧化应激模型的优化 MK-1775分子重量 【目的】以地塞米松(DEX)处理肉仔鸡胸肌卫星细胞(SCs),筛选DEX的最佳作用时间和浓度,以优化肉仔鸡卫星细胞的氧化应激模型。【方法】将体外培养的肉仔鸡胸肌SCs按DEX处理浓度(0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48和0.96 mg/ml)分为7组,分别测定培养不同时间(6 h、12 h、24 h和48 h)点SCs的存活率(MTT法),细胞及培养液丙二醛(MDA)、氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽硫转酶(GST)含量或活性。【结果】随DEX浓度升高,SCs中MDA和ROS含量极显著升高(P

天然小分子化合物鹅不食草有效成分6-氧-当归酰多梗白菜菊素(6-O-angeloylplenolin,6-OAP)对肺癌细胞的作用

天然小分子化合物鹅不食草有效成分6-氧-当归酰多梗白菜菊素(6-O-angeloylplenolin,6-OAP)对肺癌细胞的作用,及对表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)印制剂吉非替尼的增效作用。吉非替尼(Gefitinib)是1990年发现的一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor receptor inhibitor, EGFR-TKI),之后的研究发现吉非替尼具有抑制肺癌细胞的生长、转移和血管生成,并且有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,适用于治疗以前接受过化学治疗的局部晚期以及转移性非小细胞性肺癌。基于现有的临床研究结果,吉非替尼对于那些适用的病例有很好的治疗效果,然而因为吉非替尼是激酶抑制剂的原因,所以长时间使用极其容易产生抗药性以及副作用,因此在使用吉非替尼的时候经常需要停药很长时间或者和其他药物一起使用。6-氧-当归酰多梗白菜菊素(6-O-angeloylplenolin,6-OAP)是从鹅不食草中提取的一种倍半萜类小分子化合物,研究发现其对多种肿瘤具有抑制作用。实验室的前期研究发现6-OAP靶向SCF复合物诱导细胞周期G2/M期阻滞的分子机理,并且具有适应的药代动力学特征。进一步我们发现6-OAP对多种肺癌细胞系具有抑制作用,并且在小鼠模型上也具有显著的抗癌效果,前期研究发现其对多种肿瘤具有抑制作用,并且可以增加地塞米松对骨髓瘤的敏感性。因此,我们探索了6-OAP与吉非替尼联合使用是否会克服吉非替尼的耐药性。吉非替尼是表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂,抑制其下游信号通路,6-OAP通过作用于SCF复合物也作用众多的细胞通路,通过对比发现6-OAP与吉非替尼的联合用药比两药单独使用有更好抑制细胞增殖的效果,使用软件计算协同指数。因此我们选用肺腺癌细胞系A549细胞作为我们研究的主要对象,发现6-OAP与吉非替尼的联合使用可以明显的抑制晓得侵袭转移的能力,并且有明显的统计学意义,进一步研究发现6-OAP联合吉非替尼可以明显下调p-AKT、p-ERK等蛋白的水平,增强吉非替尼的抗肺癌作用,为吉非替尼耐药的病人提供了新的治疗可能,为中医药联合西药治疗癌症增加了可能。2.西药治疗疾病的优势是作用机制比较清楚,针对的病症也比较清楚,而中医药的优势在于经过数千年的传承,对于治疗疾病有着自己一整套的完整体系,而具体的作用机制不清楚,这阻碍了中医药在全世界范围内的认可。因此筛取中药中的有效成分是刻不容缓,实验室中拥有众多中药提取物,我们使用多种癌症细胞用来筛取中药中可以抗击癌症细胞系的提取物。我们发现多种抗击癌症的活性成分,Evo是我们近期发现的一个新的天然小分子化合物,初步的研究发现Evo能抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞在G2/M期阻滞,后续的研究正在进行中。沙门菌是一种革兰氏阴性兼性细胞内的细菌病原体,具有广泛的宿主谱,在全球范围内感染病例中均表现出有较高的发病率和死亡率。沙门菌的致病性主要依赖于其侵袭细胞及在细胞内生存的能力。而这又依赖于其两个毒力岛SPI-1及SPI-2编码的两个III型分泌系统(T3SS)。T3SS具有分泌和转导多种细菌毒力因子进入宿主细胞的功能。Sop selleck好不好 很少 B是SPI-1重要的分泌毒力因子,具有肌醇磷酸酶活性,在沙门菌侵入过程中可诱导多种磷酸肌醇的去磷酸化作用。Sop B已经被证明在侵染过程中影响多种细胞通路,包括细胞膜褶皱形成及抑制SCV与溶酶体的融合等。目前,对于Sop B功能的研究主要关注于其在沙门菌侵染及胞内存活过程中的作用。虽然有研究表明Sop B能够影响多种对炎性反应有调控作用的细胞信号通路,但Sop B是否影响炎性反应的报道仍不多见。炎性体是天然免疫系统的重要组成部分。炎性体是一种多蛋白复合体,在感染或应激条件下,促进促炎细胞因子成熟释放。炎性体组成包括:受体,接头蛋白及效应因子caspase-1。PRRs,包括NLR家族及ALR家族等都能启动炎性体的组装。活化的NLR或ALR促进ASC的聚集,而ASC的聚集招募caspase-1进入ASC斑点,启动caspase-1的自溶性活化,从而诱导的IL-1β及IL-18的蛋白水解过程。作为宿主重要的防御机制,炎性体的活化受到多种因素的严格调控,例如:受体的自抑制及修饰作用。病原同样可以利用毒力因子抑制炎性体功能,从而达到免疫逃逸的目的。既然,Sop B蛋白在沙门菌侵染及维持胞内存活都具有重要的作用,其是否影响沙门菌诱导的炎性体活化。因此,本研究利用λRed重组系统对沙门菌SL1344进行Sop 获悉更多 B编码基因的敲除,并以低拷贝的p STV28为表达载体分别构建了全长sop B基因回补质粒及sop B突变回补质粒。随后,将回补质粒电转至△Sop B菌株中,由此成功获得三株重组菌株,包括△Sop B::Vect,△Sop B::Sop B及△Sop B::C460S。炎性体活化试验中,为了探究Sop B蛋白是否影响沙门菌诱导的炎性体。应用ELISA方法检测Sop B对沙门菌诱导的IL-1β进行测定,LDH的释放分析细胞死亡,并应用Western blot分析caspase-1、IL-1β、AKT的活化情况及ASC寡聚化水平。免疫荧光分析ASC斑点形成水平等。结果显示沙门菌毒力因子Sop B通过诱导AKT信号活化显著抑制沙门菌诱导的炎性体活化。研究背景:乳腺癌是目前中国女性最常见的恶性肿瘤,也是全世界肿瘤致死的首要原因。三阴性乳腺癌是指免疫组织化学染色显示雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2均为阴性的一种特殊的乳腺癌。三阴性乳腺癌约占乳腺癌的12-17%,比非三阴性乳腺癌的侵袭性更强、复发转移更早,在转移性乳腺癌中生存率更低,预后更差。此外,由于三阴性乳腺癌对内分泌治无反应,目前治疗主要以手术为主,辅以全身性化疗,但该肿瘤异质性大,临床预后差,寻找有效的分子指标和治疗靶点已迫在眉睫。LETM1蛋白是一种在人类及酵母中都较为保守的线粒体内膜蛋白,它能减少线粒体的生成及ATP的产生。其表达水平的异常能诱发线粒体功能的紊乱,从而导致包括肿瘤等人类多种疾病的发生。在人类众多恶性肿瘤中都发现LETM1蛋白表达水平显著升高,但是LETM1过表达在三阴性乳腺癌中的临床病理特点和预后意义仍不清楚。本研究旨在探讨LETM1蛋白过表达在三阴性乳腺癌中的临床预后评估意义。材料与方法:选取组织标本共214例,其中包括107例三阴性乳腺癌,42例导管内原位癌,65例癌旁正常组织。首先,应用细胞免疫荧光染色检测方法分析LETM1蛋白在MCF-7乳腺癌细胞中的定位情况。然后采用免疫蛋白印迹方法在三阴性乳腺癌组织中对LETM1蛋白进行相对定量,验证LETM1蛋白在三阴性乳腺癌中是否存在过表达。最后,采用免疫组织化学方法检测LETM1蛋白在三阴性乳腺癌、导管内原位癌及正常组织中的表达情况,并分析其蛋白表达在三阴性乳腺癌中的临床病理意义。结果:1.