FOLR1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带叶酸结合蛋白基因(FOLR1)的慢病毒表达载体并进行表达鉴定。Src inhibitor,方法:PCR扩增FOLR1全长,克隆至pWPI载体质粒,重组阳性克隆行PCR和测序鉴定,重组质粒与其辅助质粒共同转染293T细胞包装病毒,病毒颗粒感染SKOV3细胞,流式分选,RT-PCR和WesternBlot检测FOLR1的表达。结果:FOLR1正确克隆至pWPI载体质粒,PCR及测序证实重组表达载体构建成功,293T细胞成功包装慢病毒,pWPI-FOLR1慢病毒高效感染SKOV3细胞,RT-PCR和WesternBlot检测出被感染后的SKOV3细胞中有FOLR1表达。结论:成功构建了FOLR1慢病毒表达载体,能高效感染SKOV3细胞,FOLR1基因转导后稳定表达,为下步探讨FOLR1在恶性卵巢肿瘤中的功能提供了实验基础. 目的:探索卵巢癌SKOV3细胞中FOLR1基因表达上调后对其生物学功能的影响以及作用途径。Survivin inhibitor,方法:MTT法测定三组细胞(SKOV3、pWPI-SKOV3、pWPI-FOLR1-SKOV3)的生长增值情况、顺铂对三组细胞的IC50和不同顺铂浓度分别作用不同时间对三组细胞的抑制率;流式细胞术检测不同顺铂浓度分别作用不同时间诱导三组细胞的凋亡率;流式细胞术检测不同顺铂浓度作用48小时对三组细胞周期分布的影响;高效液相检测同浓度顺铂作用三组细胞48小时后细胞内顺铂的浓度。结果:实验组细胞(pWPI-FOLR1-SKOV3)与两组对照组相比较:(1)增殖速度明显升高、顺铂对其作用的IC50值降低。TNF-alpha 抑制剂,(2)顺铂对其生长抑制率增加(P

卵巢癌多药耐药的研究进展

卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统常见的肿瘤,它是妇科三大恶性肿瘤之一,仅次于宫颈癌,宫体癌,居第三位。卵巢癌约占卵巢恶性肿瘤的80%,目前主要的治疗手段是手术治疗和铂类为基础的联合化疗,患者5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。MEK inhibitor,大多数卵巢患者发现时已为中晚期,有的甚至已经失去了手术机会而给予非手术治疗,75%~80%的卵巢癌开始对化疗敏感,其余则表现为原发耐药,最终所有化疗患者至少80%出现耐药,而多药耐药机制极为复杂,目前还没完全清楚,卵巢癌多药耐药产生后治疗效果明显降低。预防和减少卵巢癌多药耐药的发生,以及对卵巢癌多药耐药的逆转治疗,是现阶段迫切需要解决的问题。国外有学者曾报道叶酸结合蛋白与卵巢癌的发生发展密切相关,在多药耐药中也扮演了重要的角色,具体机制暂未明确,需要我们进一步的研究探索。 目的:探讨卵巢恶性肿瘤组织中叶酸结合蛋白(FOLR1)的表达及其临床意义。NF-κB 抑制剂,方法:采用WesternBlot检测80例卵巢恶性肿瘤组织、50例卵巢良性肿瘤组织及30例正常卵巢组织中的FOLR1表达情况,分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理及多药耐药的相关性。结果:(1)FOLR1在正常卵巢组织,卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤中的表达量依次增高(P

抗肿瘤药物CG007的体内药物分析方法建立及药代动力学研究

抗肿瘤药物CG007是目前非常热门的一种PARP-1抑制剂。经体外和药效学研究可知,CG007具有一定的抗肿瘤效果,可以延长荷瘤动物的生存期。其作用机制主要是肿瘤细胞中PARP-1含量较正常细胞中高,可以通过PARP-1抑制剂来降低肿瘤细胞内DNA的修复功能,增强癌细胞对DNA损害因子的敏感度,从而提高化疗和放疗的效果。 本文的研究目标是建立抗肿瘤药物CG007的体内药物分析方法,DHFR inhibitor,以及药物在小鼠体内的吸收及组织分布的研究,为后续的进一步研究提供参考数据。初步研究的实验结果如下: (1)建立抗肿瘤药物CG007的HPLC含量测定方法。色谱柱采用Krosmail-C18柱,流动相为甲醇:水(0.1%三氟乙酸)=60:40,流速=1.0ml/min,检测波长:276nm。 (2)建立生物样品中的CG007测定方法。预处理方法采用甲醇作为血浆的蛋白沉淀和提取剂,DNA Methyltransferase inhibitor,酸化甲醇作为组织的蛋白沉淀剂和提取剂,效果良好,回收率在95.33%-110.96%范围内,日内RSD

BRCA-1和PARP-1在三阴乳腺癌中表达及临床意义的研究

乳腺癌是当今女性最常发病的恶性肿瘤之一,在我国其发病率呈逐年增高的趋势,如何给予乳腺癌患者更好的治疗,以提高患者的治愈率和生存率,越来越受到大家的关注。其中的一个恶性程度较高的亚型——三阴乳腺癌(triplenegativebreastcarcinoma,TNBC)因为其ER、PR、Her-2均为阴性表达,缺乏内分泌治疗及靶向治疗的常规手段,故其治疗更是成为当今医学领域的热点、难点。Cilengitide,通过对BRCA-1和PARP-1在三阴、非三阴乳腺癌乳腺组织中表达及乳腺良性肿瘤和正常乳腺中表达的情况进行研究,探讨其与三阴乳腺癌的关系、两种基因间的关系以及与之相关临床参数的关系,探索其在三阴乳腺癌早期诊断、治疗、及评估预后中的作用,以提高三阴乳腺癌患者的治愈率和生存率。 方法 1、收集唐山市人民医院行手术治疗的乳腺癌患者的肿瘤及癌旁正常新鲜组织,其中三阴乳腺癌21例、非三阴乳腺癌36例;并收集乳腺良性肿瘤和瘤旁正常乳腺组织各32例作为对照,患者术前均未予任何治疗。所有组织均于术后0.5h内存于-80℃冰箱冻存。 2、采用Trizol法提取乳腺组织中的总RNA,分析RNA的浓度、纯度和完整性,检测合格后将其逆转录成cDNA,VE-822,最后采用实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePolymeraseChainReactionPCR简称Real-timePCR)方法检测BRCA-1和PARP-1在三阴乳腺癌、非三阴乳腺癌患者肿瘤及癌旁组织、乳腺良性肿瘤及正常乳腺组织中mRNA的表达情况,将GAPDH作为内参基因,并采用2-△△Ct法进行数值分析。 结果 1、BRCA-1在三阴乳腺癌患者肿瘤组织和癌旁组织中mRNA的相对表达值分别为(0.734±0.226,2.372±0.781),差异有统计学意义(P

三阴乳腺癌的特征及治疗进展

三阴性(ER、PR、HER-2均阴性)乳腺癌是具有特殊生物学行为及临床病理特征的一个乳腺癌亚型,与基底细胞样乳腺癌和BRCA1相关性乳腺癌有一定相关性。对三阴性乳腺癌的分子病理特征、Akt inhibitor,治疗现状及潜在药物靶点等方面的研究,将有助于设计更佳的治疗方案,改善预后。 三阴性乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性极强的乳腺癌亚型,临床预后很差。近几年,随着对乳腺癌生物学研究的深入,出现了一些新的治疗方法。多项临床试验已经证实,聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)抑制药应用是一种治疗BRCA基因突变或散发的、具有同源重组调节修复缺陷乳腺癌的有效方法。亚组分析提示血管内皮生长因子单克隆抗体贝伐珠单抗联合化疗能有效治疗TNBC。包括舒尼替尼和索拉非尼在内的许多药物也能抑制肿瘤血管生成。Caspase inhibitor,基因芯片分析显示,与其他乳腺癌亚型相比,TNBC表皮生长因子受体(EGFR)的表达水平更高,而EGFR抑制药治疗乳腺癌的疗效却令人失望。临床前研究还发现,热休克蛋白90(Hsp90)和Src抑制药有抑制TNBC生长的活性,相关临床试验正在进行中。 人类乳癌易感基因1/人类乳癌易感基因2相关性乳腺癌与三阴性乳腺癌在分子表型上有很多相似之处,Chk 抑制剂,这类乳腺癌治疗手段有限,患者预后差。近年来,随着对肿瘤病因学和相关信号传导通路研究的深入,对其临床、病理、生物学特征、治疗及预后有了较深入的认识,由此开发出一系列药物,并相继进入不同阶段的临床研究。 乳腺癌的治疗药物众多。多药耐药的复发或转移性乳腺癌患者,有很多可能在常规治疗失败之后考虑未曾用过的替代药物,包括:已上市但尚未被普遍认知的抗乳腺癌新药;已经上市用于其他肿瘤治疗但对乳腺癌可能有效的新药;已明确有效但一线治疗不常用于乳腺癌的细胞毒药物;已在临床研究但未上市的抗乳腺癌药物(我国肿瘤学界越来越多地加入国际多中

a-B晶体蛋白在三阴性乳腺癌中的表达及靶向治疗意义

目的:a-B晶体蛋白是小分子热休克蛋白家族的一员,其具有热休克蛋白作为分子伴侣的基本功能—参与蛋白质的折叠,组成及活性调节,但近来研究显示其与某些肿瘤的关系比较密切,并参与肿瘤的发生,发展及预后。Fas蛋白为肿瘤坏死因子受体超家族的一员,通过结合其受体Fasl激活一系列细胞内的信号级联反应,诱导细胞凋亡。Fas/Fasl系统是细胞凋亡的一个重要途径。当某些因素致其信号级联反应受阻,AZ20,则无法诱导肿瘤细胞凋亡。三阴性乳腺癌(TNBCtriplenrgativebreastcancer)是乳腺癌的一个特殊亚型,是指雌激素受体(ERestrogenreceptor)、孕激素受体(PRprogesteronereceptor)以及人类表皮生长因子受体2亚型(HER2humanepidermalgrowthfactorreceptor2)都是阴性的乳腺癌,因为其预后差,容易发生远处转移,对放疗及内分泌治疗不敏感,五年生存率低,故目前其治疗仍倚重于手术与辅助化疗。三阴性乳腺癌治疗手段相对比较局限,加之其预后较差,因此不断丰富三阴性乳腺癌的治疗手段,研发新的治疗药物,提升三阴性乳腺癌的预后,延长患者的生存期成为人们研究的重点。Dorsomorphin,本文目的在于研究a-B晶体蛋白在三阴性乳腺癌中的表达,通过分析a-B晶体蛋白与乳腺癌临床、病理各指标之间的相关性,从而探讨其在三阴性乳腺癌的预后中所起作用;并且探讨其作用机制是否与阻断Fas/Fasl系统抑制细胞凋亡有关,进而分析a-B晶体蛋白是否可以作为三阴性乳腺癌靶向治疗的一个靶点,进而研究新的靶向治疗药物,为三阴性乳腺癌的临床诊断,预后及靶向治疗提供新的研究方向。 方法:采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)S-P法检测80例经我院病理科证实为乳腺癌(其中30例为三阴性乳腺癌,50例为非三阴性乳腺癌)的石蜡标本切片组织中的a-B晶体蛋白,Fas/Fasl阳性表达率,BIIB057,比较三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌组织中a-B晶体蛋白,Fas/Fasl表达有无差异,对a-B晶体蛋白表达与乳腺癌临床及病理指标间的关系进行相关性分析,进而分析a-B晶体蛋白表达与三阴性乳腺癌临床及病理指标间的相关性,并且对a-B晶体蛋白表达与Fas/Fasl表达进行相关性分析。 结果: 1a-B晶体蛋白在不同乳腺癌组的表达 a-B晶体蛋白在三阴性乳腺癌组中的阳性表达率是66.67%(20/30),在非三阴性乳腺癌组中的阳性表达率是42.00%(21/50),说明其在三阴性乳腺癌组中的表达明显高于非三阴性乳腺癌(Χ2=4.566,P0.05) 3在三阴性乳腺癌中a-B晶体蛋白与Fas有相关性(Χ2=5.625,P

卵巢浆液性乳头状腺癌BRCA1和ATM蛋白表达水平及其临床应用研究

[背景与目的]同源重组修复(homologousrecombination,HR)是DNA双链断裂修复的主要方式之一。HR修复属于精确修复,主要针对UV和复制依赖性的DNA损伤。BRCA1和ATM是参与HR修复通路的重要分子,两者发生突变会导致细胞DNA损伤后不能被修复,Target Selective Inhibitor Library,基因组稳定性下降,最终引起细胞癌变。聚腺甘二磷酸核糖多聚酶(poly(adenosinediphosphate[ADP]-ribose)polymerases,PARP}抑制剂用于抑制PARP功能,后者在DNA单链损伤修复中起重要作用。研究显示,IPARP抑制剂可以特异性杀死BRCA1和ATM基因突变的细胞,这一现象称之为“协同致死”。目前已知遗传性卵巢癌中BRCA1基因突变较多见,PARP抑制剂的使用可能给卵巢癌的靶向治疗带来新的方向,但是在散发性卵巢癌,尤其是发病率最高的卵巢浆液性乳头状囊腺癌中,BRCA1和ATM的表达情况不甚了解。本研究主要了解散发性卵巢浆液性乳头状囊腺癌组织中BRCA1和ATM两种HR修复通路蛋白的表达情况,探讨其表达与临床病理参数有无相关性,是否对临床诊治及预后有指导意义。 [方法]收集解放军总医院2005年10月至2010年1月期间住院行手术治疗,无卵巢癌家族病史,经病理确诊为浆液性乳头状囊腺癌的卵巢癌患者97例,所有病例切除之肿瘤标本常规4%中性甲醛固定、石蜡包埋,进行相关抗原免疫组化染色,ABT-869,检测BRCA1和ATM蛋白的表达情况。复习病历并进行随访,将两种蛋白表达情况与临床病理参数结合进行统计学分析,探讨两者与临床病理各参数之间的关系以及对卵巢癌生存情况的影响。 [结果]1、在散发性卵巢浆液性乳头状囊腺癌中,BRCA1、ATM蛋白异常表达率分别为32.0%(31/97)和19.6%(19/97),总体异常表达率为45.4%;2、BRCA1和ATM蛋白表达情况与相关临床病理参数对照研究时发现,BRCA1蛋白异常表达率随着癌组织病理分级降低而增加,且具有统计学意义,BRCA1蛋白表达与临床分期、患者年龄、绝经状态等临床参数无显著相关,ATM蛋白表达与相关临床病理参数均无显著相关;3、在预后分析中,97例卵巢癌患者1年生存率为71.8%,3年生存率为48.9%,5年生存率为25%。BRCA1阳性表达组和BRCA1阴性表达组的中位生存时间分别为20.5个月和24个月,ATM阳性表达组和ATM阴性表达组的中位生存时间分别为23个月和17个月,FIGO临床分期早期(Ⅰ/Ⅱ期)患者中位生存时间34个月,Roxadustat,晚期患者(Ⅲ期)中位生存时间23个月,病理分级中分化(2级)患者中位生存时间26个月,病理分级低分化(3级)患者中位生存时间23个月,但BRCA1和ATM蛋白表达情况、肿瘤临床分期及病理分级与生存率在统计学上均无显著相关。 [结论]1、卵巢浆液性乳头状囊腺癌组织中BRCA1和ATM两种HR修复通路相关蛋白总体异常表达率为45.4%,这提示如应用PARP抑制剂,可能有近半数的卵巢浆液性乳头状囊腺癌患者受益;2、BRCA1蛋白在癌组织中表达随着分化程度下降而减少。

阴性乳腺癌的临床病理学特点及其预后影响因素

目的探讨三阴性乳腺癌(TNBC)的临床病理学特点及其预后的影响因素。方法收集经手术和病理证实的乳腺癌组织标本329例,免疫组织化学方法检测HER-2、ER、PR和p53表达,对照分析TNBC组和非三阴性乳腺癌(NTNBC)组的临床病理生物学特性,采用Kaplan-Meier法分析患者5年无瘤生存率。结果NTNBC组占79.03%(260/329)。GPCR小分子化合物库,TNBC组占20.97%(69/329),中位年龄42岁,绝经前期73.91%(51/69),浸润性导管癌73.91%(51/69),阳性表达44.93%(31/69),p53T3(T>5cm)27.54%(19/69),Ⅲ期30.43%(21/69),组织学Ⅲ级39.13%(27/69),淋巴结转移率55.07%(38/69),术后复发率27.54%(19/69),远处转移率18.84%(13/69),均高于NTNBC(P

特异性结合肽与卵巢癌靶向效应的研究

目的验证课题组前期利用噬菌体展示技术所筛选的卵巢癌特异性结合肽的靶向性及定位分布情况,将此肽命名为OSTP(OvarianCancerSpecificTargetingPeptide)。LGK-974,通过分析OSTP对卵巢癌A2780细胞的体内外特异性结合作用及对人体卵巢癌靶向效应,探索新的卵巢癌分子靶向药物。 方法1.合成OSTP并标记荧光素5-FAM。培养卵巢癌A2780细胞及对照组胃癌SGC7901细胞、骨肉瘤MG63细胞,分别加5-FAM-OSTP、50%DMSO孵育不同时间,荧光显微镜下观察拍照。 2.构建卵巢癌A2780细胞荷瘤小鼠模型,用4.9mg/ml的5-FAM-OSTP尾静脉注入裸鼠体内,对照组尾静脉注入4.9mg/ml的5-FAM-NSTP(非特异肽)200ul,溶媒对照组20%DMSO200ul,循环后进行左心室灌注,取肿瘤组织及各脏器组织,行冰冻切片,荧光显微镜下观察拍照。调整5-FAM-OSTP在体内循环时间,观察肿瘤组织荧光强度变化情况。 3.收集人卵巢癌标本38例、人卵巢囊腺瘤11例、BIO GSK-3,其他卵巢肿瘤12例、人卵巢标本10例、子宫内膜肌壁10例,进行5-FAM-OSTP免疫荧光染色,浓度为2.0mg/ml并用DAPI复染,观察荧光结合情况,相同组织切片予HE染色常规诊断。检测OSTP对卵巢癌的特异性结合作用。 结果1.成功合成和标记5-FAM-OSTP。细胞免疫荧光显示:溶媒对照组均不产生荧光;5-FAM-OSTP孵育后的卵巢癌A2780细胞产生较明亮的黄绿色荧光,胞膜明显。而对照组SGC7901、MG63细胞不产生荧光。 2.5-FAM-OSTP裸鼠体内循环实验结果显示:5-FAM-OSTP在卵巢癌荷瘤裸鼠肿瘤组织可见强荧光信号,AVL-301,而5-FAM-NSTP(非特异肽)、20%DMSO在肿瘤组织无明显荧光信号。采用ImageJ软件进行荧光强度分析5-FAM-OSTP在各组织的荧光信号,肿瘤组织平均荧光强度为70.148±3.109;肾组织平均荧光强度9.861±0.502;肝组织平均荧光强度8.575±0.381;肿瘤组织与肝、肾组织的荧光强度差异有显著性(P

PARP-1抑制剂对人肝癌细胞株HepG2生物学特性影响的实验研究

目的观察三种不同的PARP-1抑制剂对人肝癌细胞株HepG2细胞生物学特性的影响;初步探讨PARP-1抑制剂诱导HepG2细胞增殖和凋亡的机制,为肝癌提供一种新的治疗靶点。方法运用MTT实验观察不同浓度的三种PARP-1抑制剂(AG014699、BSI-201、AZD-2281)对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的抑制作用,选择敏感的两种PARP-1印制剂AGO14699和BSI-201,GSK2656157,用流式细胞术(FCM)检测PARP-1抑制剂对HepG2细胞凋亡的影响;用WesternBlot法检测PARP-1抑制剂对Casepase3,Casepase8,Bax,Bcl-2蛋白的表达水平。用Transwell实验检测AG014699和BSI-201对人肝癌细胞株HepG2细胞迁移的影响。结果三种不同的PARP-1抑制剂(AG014699,BSI-201,AZD-2281)均具有抑制HepG2细胞增殖的作用,具有时间和浓度依赖性,但敏感性不同。AG014699,BSI-201(iniparib),AZD-2281(olaparib)作用48h的IC50分别约为20μmo1/1,30μmol/l,400μmol/1。用流式细胞术检测敏感的两种PARP-1抑制剂AG014699和BSI-201诱导HepG2细胞凋亡的作用,用10μmol/1,30μmol/1,50μmol/1的AG014699口20μmol/1,40μmol/1,60μmol/1的BSI-201均能诱导HepG2细胞凋亡,48h时凋亡率明显高于对照组,二者有显著性差异(31%vs0.01%,t=15.019,P