Monthly Archive: September 2016

PARP-1抑制剂对人肝癌细胞株HepG2生物学特性影响的实验研究

目的观察三种不同的PARP-1抑制剂对人肝癌细胞株HepG2细胞生物学特性的影响;初步探讨PARP-1抑制剂诱导HepG2细胞增殖和凋亡的机制,为肝癌提供一种新的治疗靶点。方法运用MTT实验观察不同浓度的三种PARP-1抑制剂(AG014699、BSI-201、AZD-2281)对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的抑制作用,选择敏感的两种PARP-1印制剂AGO14699和BSI-201,GSK2656157,用流式细胞术(FCM)检测PARP-1抑制剂对HepG2细胞凋亡的影响;用WesternBlot法检测PARP-1抑制剂对Casepase3,Casepase8,Bax,Bcl-2蛋白的表达水平。用Transwell实验检测AG014699和BSI-201对人肝癌细胞株HepG2细胞迁移的影响。结果三种不同的PARP-1抑制剂(AG014699,BSI-201,AZD-2281)均具有抑制HepG2细胞增殖的作用,具有时间和浓度依赖性,但敏感性不同。AG014699,BSI-201(iniparib),AZD-2281(olaparib)作用48h的IC50分别约为20μmo1/1,30μmol/l,400μmol/1。用流式细胞术检测敏感的两种PARP-1抑制剂AG014699和BSI-201诱导HepG2细胞凋亡的作用,用10μmol/1,30μmol/1,50μmol/1的AG014699口20μmol/1,40μmol/1,60μmol/1的BSI-201均能诱导HepG2细胞凋亡,48h时凋亡率明显高于对照组,二者有显著性差异(31%vs0.01%,t=15.019,P

台湾地区乳腺癌患者中医体质与证型类型分布规律及与受体的相关性研究

目的: 乳腺癌为女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率越占全身各种恶性肿瘤的7%-10%。发病率较高的是绝经期前后的妇女。通过对台湾省地区几间医院女性患者进行乳腺癌与中医体质和证型类型分布规律方面和受体(ER,PR,HER-2三大受体是阳性还是阴性)情况调查研究,初步探讨乳腺癌的患病中医体质和证型类型分布特点;二是探明乳腺癌体质与受体情况的相关性。 方法: 调查对象: 本次调查以台湾地区收集首次病理诊断为乳腺癌患者问卷,AC220,以及就诊于台北医院的门诊及住院部乳腺癌病例和癌友新生命协会乳腺癌病例。 调查内容: 1、使用王琦教授创制的中医体质量表为基础,制订了《中医体质及健康状况自填式问卷》(以下简称《问卷表》)。中医体质分型是以王琦教授体质分类为标准,体质类型分为九大型,即:平和质、气虚质、阳虚质、阴虚质、瘀血质、痰湿质、湿热质、气郁质、特禀质等。 2、目前依照较有权威性的乳腺癌中医证候分类和预后因素的相关性的研究为国家中医药管理局制定的分型标准。《中医病症疗效标准》是国家中医药管理局颁布zY/T001.2—94将乳腺癌分成3型:肝郁痰凝、冲任失调、正虚毒炽,此即是本次研究乳腺癌辨证分型的依据。 3、使用免疫组化(HC)检测乳腺癌受体ER、PR、Her-2。研究相关参数:发病年龄、月经状态、肿瘤大小、淋巴结转移状态、临床病理类型、临床分期同ER、PR、Her-2的相关性。 实施方法: 本研究是有效取得适合本研究研究范围之对象,KU-60019,因此采取便利抽样本。而是对门诊及住院、癌友协会临床诊断为乳腺癌患者发放《问卷表》,并请患者当场收回信息采集由门诊及住院、癌友协会专业医师负责,相关信息输入并存放在体检中心电脑系统。收集病例共100例,使用流行病学病例分析。运用计数资料经卡方检验,P>0.05,并提示无显着性差异,具有可比性。采用SPSS17.0统计软件,统计学方法对计数资料进行秩和检验、卡方检验,对多变量数据进行Logistic回归分析等。 结果: 1、台湾地区100例乳腺癌患者中医体质分布由多到少依次为:气郁质(20%),阴虚质(16%),阳虚质(15%),气虚质(14%),血瘀质(12%),平和质(10%),痰湿质(5%),湿热质(4%),特禀质(4%)。体质与年龄、激素受体表达之间无明显相关性(P0.05,提示各体质类型与ER、PR受体之间无明显统计学差异。体质类型与Her-2受体表达情况进行统计学分析,结果显示,Her-2阳性表达率与乳腺癌实证型体质要素无明显相关性,与虚证型体质要素具有相关性,阳虚、气虚患者Her-2阳性表达率高,提示应于益气温阳药物可改善患者预后。 4、台湾地区乳腺癌患者中医证型类型,与受体ER、PR、Her-2受体表达情况进行统计学分析,肝郁痰凝型阳性率与正虚毒炽型比较,而差异无显着性(P=0.074);肝郁痰凝型ER阳性率与冲任失调型比较,而差异有显着性(P=0.022)。各证型PR、Her-2阳性率比较,而差异无显着性。乳腺癌早期多是肝郁痰凝型,后期以正虚毒炽型为主。肝郁痰凝型表达水平高于冲任失调型,而PR、Her-2的表达与中医证型皆无明显相关性。 5、台湾地区三阴性乳腺癌患者中医体质分布为:平和质0例、气虚质4例、阳虚质2例、阴虚质1例、血瘀质2例、痰湿质3例、湿热质1例、气郁质6例、特禀质2例。 6、台湾地区三阴性乳腺癌患者中医证型类型在早、中期以肝郁痰凝证和冲任失调证为主,在晚期以正虚毒炽证为主;冲任失证预后不良的组织学类型比例高于其它证型;正虚毒炽证预后不良的临床病理指标多于其它证型,提示正虚毒炽证患者病情较重,预后可能要比其它证型差,三组证型预后的比较需要通过对患者有长期随访才能判断。 结论: 本文通过对100例台湾地区乳腺癌患者问卷调查,初步探讨乳腺癌的患病中医体质和证型类型分布特点;二是探明乳腺癌体质和证型与受体(ER、PR、Her-2)情况的相关性。本研究得出以下结论: 1.台湾地区乳腺癌患者中医体质分布集中在气郁质、阴虚质、阳虚质、气虚质、血瘀质。 2.台湾地区乳腺癌患者中医证型类型分布集中在冲任失调证和肝郁痰凝证。 3.台湾地区乳腺癌患者中医体质与受体ER、PR受体表达情况进行统计学分析,结果显示,P>0.05,提示体质类型与ER、PR受体无明显统计学差异。体质类型与Her-2受体表达情况进行统计学分析,结果显示,Her-2阳性表达率与乳腺癌实证型体质要素无明显相关性,与虚证型体质要素具有相关性,阳虚、气虚患者Her-2阳性表达率高,提示应予以益气温阳药物可改善患者预后。 4.台湾地区乳腺癌患者中医证型类型,与受体ER、PR受体表达情况进行统计学分析,结果显示,P>0.05,提示无明显统计学差异。证型与Her-2,冲任失调证的Her-2蛋白的表达明显高于其它两组,统计学分析,有显着性差异。 5.台湾地区三阴性乳腺癌患者中医体质分布集中在气郁质、阴虚质、阳虚质、气虚质、血瘀质、痰湿质。 6.台湾地区三阴性乳腺癌患者中医证型类型分布集中在早、中期以肝郁痰凝证和冲任失调证为主,在晚期以正虚毒炽证为主。

乳腺癌干细胞的靶向治疗研究

目前,乳腺癌干细胞的靶向治疗研究主要有:(1)DNA损伤修复阻断剂,如ADP核糖聚合酶1(PARPI)阻断剂;(2)细胞表面受体,如EGFR、C-Kit;(3)血管表皮生长因子受体vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)receptor抑制剂;AT7519,(4)Src激酶抑制剂;(5)哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白mammaliantargetofrapamycin(roTOR);(6)白细胞介素IL;(7)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand(TRAIL)等。人类黑色素瘤分化相关基因-7/白介素-24(Melanomadiffrentiation-associatedgene-7/interleukin-24,MDA-7/IL-24)是一个新型的、MK-1775,具有细胞因子样特性的肿瘤抑制基因,是IL-10细胞因子家族的新成员。它编码分泌型蛋白产物(secretedMDA-7/IL-24protein,sMDA-7/IL-24),与免疫系统的白介素功能相同,并具有抑制肿瘤生长及特异性诱导肿瘤细胞凋亡的能力。目前的实验研究表明IL-24在抑制和分化肿瘤细胞,促进肿瘤细胞凋亡;同时抑制肿瘤周围血管形成;增强肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性;抑制肿瘤细胞的侵袭和转移等方面具有重要作用。IL-24具有多效性、选择性、重叠性、协同性、拮抗性和网络性双重性作用特点。但在研究中发现IL-24并不能完全消灭种植在裸鼠身上的肿瘤。解决这一问题的方法有二种:(1)与其他细胞因子联合;(2)使细胞因子可以稳定高效地表达作用在肿瘤部位。有报道指IL-24能诱导并增强肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TumorNecrosisFactor-relatedrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL)的活性。AC220,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumornecrosisfactor-RelatedApoptosisInducingLigand,TRAIL)或称凋亡素2配体(Apo-2ligand,Apo2L)是由Wiley等从人心肌cDNA文库中克隆出来的,因其氨基酸顺序具有TNF超家族的结构特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得名,因其能诱导不同来源的肿瘤细胞以及病毒转化的细胞发生凋亡,而对正常组织细胞不具有毒性,不会导致正常细胞发生凋亡,同时与其它抗肿瘤药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞,所以成为肿瘤治疗领域的研究热点,是一种新型的抗肿瘤药物。目前的研究认为TRAIL主要通过位于细胞膜的死亡受体DR4和DR5通过其胞外区与TRAIL结合后活化,其胞内死亡功能域DD传导凋亡信号,活化了细胞内的FADD-caspase途径,激活线粒体非依赖性和线粒体依赖性二种途径介导凋亡的发生。本课题最后拟重组构建IL-24-TRAIL的基因载体,尝试解决细胞因子在治疗乳腺癌干细胞中存在的疗效差、副作用大以及安全性不保障等方面的缺点,为乳腺癌干细胞的基因治疗提供新的实验和理论依据,使广大的乳腺癌患者尤其三阴耐药乳腺癌因本项目而受益。本项研究具有潜在的巨大社会效益和经济效益。

PARP抑制剂的筛选与活性评价

PARP-1是一种参与翻译后修饰的DNA修复蛋白,是癌症治疗中的新靶点,ZD1839,寻找和开发高效的PARP抑制剂具有广阔的治疗前景。建立高效稳定的PARP活性测定方法、寻找合适的体内外抗癌研究细胞模型是发现新型PARP抑制剂的重要方法和手段。 本文首先采用剩余底物定量法建立PARP-1的体外活性测定方法:确定底物NAD+浓度为12.5nmol•L-1,激活剂DNA浓度为15μg•mL-1。并以6.25×10-4UPARP-1建立PARP抑制剂的反应体系,得到Z’因子、S/B和CV值均满足高通量筛选模型,Rapamycin,测得已知PARP抑制剂AZD2281的IC50为13nmol•L-1±2nmol•L-1。最终从82个化合物中筛选出52个对PARP-1的抑制率达50%以上,得到IC50小于0.5μmol•L-1的化合物11个。 其次,以Hela细胞为模型建立细胞水平的PARPs活性评价方法:用DNA损伤试剂MNNG激活细胞内PARPs,15min时以ATP含量的变化为指标,建立间接的PARPs活性测定方法;5min时以PAR的变化为指标,建立直接的PARPs活性检测方法。并分别以AZD2281进行验证,NSC683864,基于此模型从17个化合物中筛选得到8个化合物的EC50为3μmol•L-1-9μmol•L-1,化合物25号和47号对细胞PARPs的抑制作用呈浓度依赖关系。 最后,利用PARP抑制剂敏感型细胞进行化合物体内外的抗肿瘤功能性评价:验证了JF-305细胞对AZD2281的敏感性并发现AZD2281通过诱导DSBs损伤、引起细胞周期阻滞于S、G2/M期而导致JF-305细胞的凋亡;细胞活力检测及克隆形成实验发现47号化合物对MDA-MB-436及JF-305表现出细胞毒性作用,对JF-305的肿瘤生长有一定的抑制作用。 本课题建立了体外PARP-1的活性测定方法和细胞水平PARPs的活性测定方法,选用一株对PARP抑制剂敏感的细胞应用于体内外的肿瘤抑制实验,建立了一套灵活稳定的寻找和发现具有抗肿瘤活性的PARP抑制剂的方法。

新型PARP抑制剂WZ-8体内外抗肿瘤作用研究

新型PARP抑制剂WZ-8是在Iniparib(INBA,BSI-201)的基础上进行结构修饰而得到的一种化合物,本研究评价了WZ-8对各种来源的人肿瘤细胞株增殖的抑制作用,并且研究了WZ-8对人源裸小鼠移植瘤模型的实验治疗作用。 方法:1)采用SRB法测定WZ-8单用对各种来源的人肿瘤细胞体外增殖的抑制作用。2)采用SRB法测定WZ-8联合各类抗肿瘤药物对各种来源的人肿瘤细胞体外增殖的抑制作用。3)WZ-8化合物单用对MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的作用研究。Cediranib,4)WZ-8合用吉西他滨对HCT116裸小鼠移植瘤的作用研究。5)WZ-8及BSI-201合用吉西他滨对HCT116裸小鼠移植瘤的作用研究。6)WZ-8合用顺铂对HCT116裸小鼠移植瘤的作用研究。 结果:1)WZ-8对各类人肿瘤细胞株的ICso在0.21-1.17μg/ml,对肿瘤细胞的抑制作用明显强于阳性对照INBA,表现出较好的抗肿瘤活性。2)WZ-8合用顺铂对A431、PC3、SGC-7901、MCF-7细胞的抗增殖作用均表现为叠加作用,对MDA-MB-231细胞的抗增殖作用表现为拮抗作用、对KB细胞的抗增殖作用表现为叠加作用或拮抗作用、对HCT116、A2780、786-0、A549、MDA-MB-436细胞均没有表现出协同作用。Dovitinib,WZ-8合用吉西他滨或TPT或VP-16对MCF-7、MDA-MB-231细胞的抗增殖作用均表现为拮抗作用。3)WZ-8化合物单用对MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的作用研究中,Taxol1Omg/kg,WZ-825mg/kg,WZ-812.5mg/kg和WZ-86.25mg/kg组第21天的肿瘤体积分别为1209±160mm3,1268±188mm3,1465±283mm3和1501±336mm3,相对肿瘤体积分别为6.9±0.8,9.1±1.0,9.8±0.9和10.1±2.0,T/C值分别为61.8%,82.3%,87.8%和91.3%,对应的肿瘤重量分别为0.66±0.08g,0.90±0.19g,0.98±0.25g和1.01±0.25g,抑瘤率分别为25.5%,13.9%,5.8%和3.3%。4)WZ-8合用吉西他滨对HCT116裸小鼠移植瘤的作用研究中,吉西他滨100mg/kg、吉西他滨50mg/kg、吉西他滨25mg/kg、WZ-825mg/kg、WZ-825mg/kg合用吉西他滨100mg/kg、WZ-825mg/kg合用吉西他滨50mg/kg和WZ-825mg/kg合用吉西他滨25mg/kg组第21天的肿瘤体积分别为1420±443mm3、1480±199mm3、1392±417mm3、2255±307mm3、703±132mm3、1396±373mm3和3129mm3,相对肿瘤体积分别为5.0±1.2、6.2±1.5、6.8±3.0、8.7±2.9、5.8±3.4、5.6±1.7和3.4,T/C值分别为39.7%、49.1%、54.2%、68.7%、45.9%、44.7%和26.8%,对应的肿瘤重量分别为1.22±0.27g、1.49±0.14g、1.49±0.28g、2.15±0.44g、1.04±0.19g、1.30±0.32g和2.52g,ZD1839,抑瘤率分别为54.1%、44.3%、44.0%、19.4%、60.8%、51.4%和5.5%。5)WZ-8及BSI-201合用吉西他滨对HCT116裸小鼠移植瘤的作用研究中,WZ-825mg/kg、WZ-812.5mg/kg、吉西他滨130mg/kg、WZ-825mg/kg合用吉西他滨130mg/kg和WZ-812.5mg/kg合用吉西他滨130mg/kg组第27天的肿瘤体积分别为1679±217mm3、1725±448mm3、799±69mm3、895±137mm3和687±138mm3(溶剂对照组肿瘤体积为2409±236mm3),相对肿瘤体积分别为10.9±0.8、10.9±1.5、4.9±0.4、5.4±0.6和4.8±1.0,T/C值分别为71.2%、71.1%、32.3%、35.1和31.0%。BSI-20190mg/kg、吉西他滨130mg/kg和BSI-20190mg/kg合用吉西他滨130mg/kg组第27天的肿瘤体积分别为2114±239mm3、799±69mm3和913±136mm3(溶剂对照组肿瘤体积为2409±236mm3),相对肿瘤体积分别为14.0±2.5、5.0±0.4和6.0±1.0,T/C值分别91.1%、32.3%和39.4%。处死小鼠,剖取瘤块称重,WZ-825mg/kg、WZ-812.5mg/kg、吉西他滨130mg/kg、WZ-825mg/kg合用吉西他滨130mg/kg和WZ-812.5mg/kg合用吉西他滨130mg/kg组的肿瘤重量分别为1.46±0.15g、1.41±0.47g、0.69±0.07g、0.72±0.12g和0.79±0.04g(溶剂对照组的瘤重为1.04±0.12g),抑瘤率分别为37.4%、39.5%、70.4%、69.0%和66.2%;BSI-20190mg/kg.吉西他滨130mg/kg和BSI-20190mg/kg合用吉西他滨130mg/kg组的肿瘤重量分别为2.05±0.35g、0.69±0.07g和0.76±0.12g(溶剂对照组的瘤重为1.04±0.12g),抑瘤率分别为11.9%、70.4%和67.3%。 结论:WZ-8和INBA对10株不同组织来源的人肿瘤细胞表现出不同的增殖抑制活性,WZ-8的IC50在0.2-1.2μg/ml之间,优于INBA的抗肿瘤活性(IC50:20-60μg/ml之间)。WZ-8与吉西他滨或顺铂的联合使用可以减缓荷HCT116人结肠癌裸小鼠移植瘤肿瘤体积的增长,具有一定的抑制肿瘤生长的作用,WZ-8单用及与抗肿瘤药物联合使用在体内外抗肿瘤活性表明WZ-8作为特异性的PARP抑制剂,有望开发为一类新型的抗肿瘤创新药物,这一研究为拓展PARP抑制剂的临床应用及PARP抑制剂的开发提供理论及实验依据。

肿瘤相关抗原TM4SF1对卵巢癌细胞生物学功能影响的初步研究

第一部分TM4SF1蛋白在人上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义 目的探讨TM4SF1蛋白在人卵巢组织及卵巢癌相应淋巴结转移灶中的表达及其与上皮性卵巢癌(EOC)临床病理因素的关系。 方法采用免疫组织化学SP法检测16例正常卵巢上皮组织、23例上皮性卵巢良性肿瘤组织、55例上皮性卵巢癌原发灶及30例配对淋巴结转移灶组织中TM4SF1蛋白的表达情况,分析其与上皮性卵巢癌临床病理因素及预后的关系。 结果(1)TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率(90.90%)Integrase 抑制剂,高于上皮性卵巢良性肿瘤组织(65.22%)及正常卵巢上皮组织(31.25%)、上皮性卵巢良性肿瘤组织中TM4SF1蛋白的阳性表达率高于正常卵巢上皮组织,差异均有统计学意义(P

银莲花素A对卵巢癌细胞Skov3的抑瘤作用及机制研究

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,因其发病隐匿、进展迅速,使得70%~80%的患者发现时已为晚期,给临床治疗带来较大困难。尽管人们不断开展卵巢癌的相关研究,但其起源和发病机制至今仍未完全阐明。在卵巢恶性肿瘤中,IGF-1R 抑制剂,上皮性卵巢癌(Epithelialovariancancer,EOC)约占90%[1,2]。有研究表明,上皮性卵巢癌不是独立的疾病,而是一组不同的肿瘤,可以根据形态和遗传分子特征进行分类[3]。目前国际妇产科联盟(TheInternationalFederationofGynecologyandObstetrics,FIGO)和美国国家综合癌症网(TheNationalComprehensiveCancerNetwork,NCCN)推荐的标准治疗方案是肿瘤细胞减灭术辅以紫杉醇和铂类为主的联合化疗,但由于长期化疗使得肿瘤细胞对铂类药物产生耐药从而引起复发[4,5],同时化疗药物副反应较大,IKK inhibitor,药物价格昂贵等因素,常常导致化疗中断从而影响治疗效果,使得卵巢癌患者五年生存率一直徘徊在40%左右[5],绝大部分患者在无瘤生存18个月后复发[6]。因此,减轻化疗药物的毒副作用、逆转卵巢癌细胞耐药性等问题是目前研究的热点和难点。寻找可抑制肿瘤生长、转移以及逆转耐药的纯天然有效制剂就显得尤为重要。 祖国传统医学是中华民族的精粹,中药治疗肿瘤在我国具有悠久的历史,因中药的抑瘤效果好、副作用小、成本低等优点,近年来受到国际社会的关注。多被银莲花(A.raddeanaRegel)的根茎中药名为两头尖,又名竹节香附,是我国的传统中药,其具有祛风利湿、消肿止痹之功效,可用于治疗风寒湿痹、骨节疼痛、四肢拘挛、痈肿溃烂等症[7]。随着现代药理研究的不断深入,人们发现多被银莲花在消肿止痛、抗菌抑菌、免疫调节以及抗肿瘤方面具有较好的药用价值。上世纪80年代从该药中分离出的银莲花素A具有抗癌活性[8],且可能没有诱变染色体的副作用[9]。多被银莲花提取物在体内、外均具有较好的抑瘤作用,诱导肿瘤细胞凋亡是其发挥抗肿瘤作用的一条重要途径,同时还可通过调节机体免疫的机制发挥抗肿瘤作用[10]。已有学者发现,银莲花素A对结肠癌、肺癌、肝癌以及宫颈癌具有明显的抑制作用,但在卵巢癌方面的研究少见。本课题以多被银莲花的提取物银莲花素A为研究对象,Integrase 抑制剂,探讨不同浓度的银莲花素A单体对卵巢癌细胞Skov3增殖、凋亡及迁移、侵袭能力的影响,并通过RealtimePCR检测Bax、Caspase3、Bcl-2、Stat3、MMP-2、MMP-9、CyclinD1基因的转录;Western-blot检测CyclinD1、CyclinB1、Bcl-2、Cyt-c、Caspase-3、Bcl-xL、Bax、MMP-9、MMP-2、Stat3蛋白的表达,探讨其作用机制,为银莲花素A单体治疗卵巢癌的临床应用及其进一步开发提供理论依据。

腺病毒介导hSulf-1表达对肿瘤细胞周期的影响

【目的】研究腺病毒介导的hSulf-1基因感染肝癌和乳腺癌细胞系后,细胞周期分布的变化。 【方法】采用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1基因在肝癌细胞系和乳腺癌细胞系中的表达情况,Histone Methyltransferase 抑制剂,用流式细胞术检测肿瘤细胞过表达hSulf-1基因后细胞周期分布变化。 【结果】蛋白质免疫印迹检测hSulf-1在肝癌细胞系SMMC-7721、MHCC-97L及乳腺癌细胞系MCF-7中低表达,流式细胞术检测结果显示:hSulf-1低表达肿瘤细胞感染Ad5-hSulf1后细胞周期出现G2/M期阻滞。 【结论】hSulf-1基因的过表达可引起肿瘤细胞周期分布变化。 第三部分腺病毒介导hSulf-1表达拮抗bFGF引起的肝癌细胞周期变化及抗肿瘤效应 【目的】研究hSulf-1拮抗bFGF引起的肝癌细胞周期变化及其抗肿瘤效应。 【方法】以bFGF诱导刺激肝癌细胞SMMC-7721和肝正常细胞WRL-68,然后感染Ad5-hSulf1;IAP 抑制剂,流式细胞术检测细胞周期变化,蛋白免疫印迹检测细胞周期相关蛋白CDK4、E2F的变化,MTT、Transwell、划痕实验分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力变化。 【结果】流式细胞术实验结果表明,hSulf-1基因能够拮抗bFGF刺激引起的细胞周期演进,诱导细胞周期阻滞。蛋白免疫印迹实验结果表明bFGF刺激后的SMMC-7721细胞周期相关蛋白CDK4、E2F上调,而hSulf-1可明显拮抗bFGF的作用,下调这两种蛋白的表达。MTT实验结果表明,hSulf-1基因可拮抗bFGF引起的细胞增殖。Transwell和划痕实验结果表明,hSulf-1可拮抗bFGF的作用,抑制SMMC-7721细胞的侵袭和转移。 【结论】hSulf-1拮抗bFGF刺激引起的肝癌细胞周期变化并且能抑制细胞的增殖、侵袭和迁移能力。第四部分腺病毒介导hSulf-1表达提高乳腺癌细胞MCF-7对 AZD2281敏感性的研究 【目的】探讨人硫酸酯酶-1(humansulfatase1,hSulf-1)基因重组腺病毒Ad5-hSulf1对乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移及其化疗敏感性的影响。 【方法】将重组腺病毒Ad5-hSulf1感染MCF-7细胞,采用不同浓度AZD2281处理细胞,并筛选AZD2281处理的最佳浓度用于后续实验,采用流式细胞术检测细胞周期,用软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成率,蛋白免疫印迹检测细胞周期蛋白CDK4及p-AKT的表达,Transwell法、MTT法分别检测细胞迁移及增殖能力。 【结果】AZD2281浓度为7μmol/L时对MCF-7细胞的抑制作用趋于峰值,用于后续实验。Ad5-hSulf1+AZD2281组与AZD2281组相比,G2/M期细胞比例明显增多,细胞克隆形成率及细胞周期蛋白CDK4的表达、AKT的磷酸化水平均明显下调,同时细胞增殖率、迁移率也有明显下降。 【结论】hSulf-1过表达可明显提高乳腺癌细胞MCF-7对AZD2281的敏感性,阻滞细胞周期于G2/M期,并抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移能力,从而为乳腺癌的药物治疗提供新的临床参考依据。

CHFR调控CHD1L降解的分子机制及其在乳腺癌中的意义

乳腺癌是全球范围内最常见的女性恶性肿瘤,严重危害女性的身体健康。DNA损伤修复在乳腺癌发生发展中起到非常关键的作用。 CHD1L是一个DNA损伤应答基因。CHIR-98014,当DNA损伤发生后,CHD1L能快速的定位到DNA损伤位置,并参与DNA损伤修复。同时CHD1L也是一个原癌基因,在多种肿瘤中高表达。但CHD1L与乳腺癌的关系目前还没有报道。因此研究CHD1L参与乳腺癌发生发展的分子机制对于乳腺癌的预防,诊断和治疗都具有重要的意义。 论文第一部分通过组织芯片研究CHD1L蛋白在乳腺癌组织中的表达情况,CH5424802,发现CHD1L蛋白在乳腺癌组织中表达阳性率明显高于癌旁组织;而通过RT-PCR检测乳腺癌组织与癌旁组织中CHD1L基因mRNA水平表达情况,结果表明CHD1L基因在乳腺癌和癌旁组织中mRNA表达水平并没有明显差异。这一结果提示,CHD1L蛋白在乳腺癌组织中高表达可能是通过翻译后修饰调控而导致的。进一步分析发现CHD1L表达与乳腺癌患者的预后密切相关,可以作为乳腺癌预后不良的分子标记物。 为了阐明CHD1L在乳腺癌中高表达的分子机制,论文第二部分通过串联亲和纯化结合质谱分析发现泛素链接酶CHFR是一个新的CHD1L相互作用蛋白。与CHD1L一样,CHFR也参与DNA损伤修复。但与CHD1L是原癌基因不同的是,CHFR被认为是一个抑癌基因,因为其启动子区域的高甲基化,在多种肿瘤,包括乳腺癌中都低表达或不表达。通过免疫共沉淀等方法,在体内、体外进一步验证CHFR与CHD1L蛋白相互作用,3-MA,并发现CHFR通过其PBZ结构域与被PAR修饰的CHD1L相结合,而PARP抑制剂能阻止CHFR与CHD1L相互作用,表明CHFR与CHD1L相互作用依赖于PAR。CHFR能在体内泛素化并降解CHD1L,提示在乳腺癌中,CHFR沉默可能是CHD1L高表达的原因。 总之,本论文发现CHFR是CHD1L相互作用蛋白,并阐述CHFR与CHD1L相互作用的分子机制及其在乳腺癌发生发展中的生物学意义,并且为PARP抑制剂在乳腺癌中治疗失败的原因提出新的假说。

PARP抑制剂PJ34对三阴性乳腺癌细胞的放射增敏作用及其机制研究

目的:本课题第一部分的研究结果显示,三阴性乳腺癌患者中放疗有效,SCH 900776,但效应尚需进一步的提高;本课题第二部分的前期基础研究验证了三阴性乳腺癌细胞比ERa型细胞的放射敏感性更低的临床观察,并且发现三阴性乳腺癌细胞更强的DNA损伤修复能力是导致其相对放射抗拒的重要因素,因而我们推测针对性使用靶向DNA损伤修复的药物可能达到放射增敏作用。因此本课题拟从体外研究水平研究第三代PARP抑制剂PJ34这一DNA损伤修复抑制剂对三阴性乳腺癌细胞放射敏感性的影响及其中的机制。 材料和方法:实验分为空白组、单纯药物组、单纯照射组和药物联合照射组。PF-04691502,采用CCK-8法检测不同浓度的PI34对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231(231细胞)的生长抑制作用,并计算IC50值。CCK-8法检测不同浓度的PI34对照射后细胞增殖能力的影响;单次照射细胞克隆形成实验检测不同PI34浓度对231细胞放射敏感性的影响;分次照射克隆形成实验检测PJ34对231细胞亚致死性损伤修复能力的影响;细胞免疫荧光检测不同处理组细胞核γH2AX焦点数的差异;流式细胞仪检测不同处理组细胞周期分布和细胞凋亡之间的差异。 结果:PI34对231细胞产生了时间依赖性的细胞生长抑制,CHIR-98014,处理24h、48h和72h后231细胞的IC50分别为17.90±0.46、18.12±0.65和15.15±0.91μM。选择处理24h组中20%~50%IC50范围内的3μM和10μM两个药物浓度进行后续的放射增敏实验。单次照射细胞存活曲线结果显示,PI34对231细胞有放射增敏效应;分次照射细胞存活曲线结果显示,PI34抑制了231细胞的亚致死性损伤修复的能力;细胞免疫荧光检测γH2AX结果显示PI34增加了照射后231细胞的DNA损伤、并延迟了损伤的修复;细胞周期检测结果显示,药物对照射后的两株细胞均产生了浓度依赖性和时间依赖性的G2/M期阻滞的增多;细胞凋亡检测结果发现,PI34对照射后231细胞的凋亡无明显影响。 结论:本研究发现PJ34对三阴性乳腺癌细胞231细胞有放射增敏效应。其中可能的机制是PI34增加细胞照射后的增殖抑制,促进细胞G2/M期阻滞,减少细胞对亚致死性损伤的修复,增加DNA双链断裂损伤,从而达到放射增敏作用。