Monthly Archive: October 2016

05,P 0 05),与肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期相关(P 0 05)。 3 42例结肠癌组织中,PTEN阳性表

05,P 0.05),与肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期相关(P 0.05)。 3.42例结肠癌组织中,PTEN阳性表达但PI3K阴性表达为9例,PI3K阳性表达但PTEN阴性表达为13例,PTEN及PI3K同时阳性表达为14例,PTEN、PI3K同时阴性表达为6例。两者的表达呈显著负相关(r=-0.325,P=0.0230.05)。 5.42例结肠癌患者中PTEN阳性表达者的中位TTP为22.17个月,阴性表达者的中位TTP为12.25个月,前者明显高于后者且有统计学意义(χ2=21.429,P=0.0000.05)。 结论: 1.PTEN与结肠癌的发生及疾病进展时间相关,且参与了结肠癌的浸润、转移,有可能作为重要指标评价结肠癌预后。 PF-573228细胞系 2.PI3K与结肠癌的发生相关,但与结肠癌的浸润、转移及疾病进展时间无关,与结肠癌预后无相关性。 3.PTEN、PI3K在结肠癌中的表达呈负相关,表明PTEN的缺失可能引起PI3K信号通路的激活,两者均与结肠癌的发生密切相关,可指导结肠癌的个体化治疗。目’的: 1.研究P13K新型抑制剂BKM120对不同分子分型乳腺癌细胞系及相应干细胞的作用,观察BKM120对不同乳腺癌干细胞生物学特性的影响。 2.研究BKM120联合多西紫杉醇对不同分子分型乳腺癌细胞系及相应干细胞的作用,观察BKM120联合多西紫杉醇用药对乳腺癌干细胞的影响。 3.研究BKM120联合靶向治疗药物曲妥珠单抗对HER2阳性的SK-BR-3乳腺癌细胞系及相应干细胞的作用,观察BKM120联合曲妥珠单抗对乳腺癌干细胞的影响。 4.研究BKM120联合多西紫杉醇在体内实验中对乳腺癌干细胞的作用。方法: 1.体外细胞学实验:采用无血清培养液悬浮培养球囊细胞的方法富集相应乳腺癌细胞系干细胞,并经过流式验证其中ESA+CD44+CD24-/low细胞亚群比例。采用MTT法分别检测BKM120、多西紫杉醇、曲妥珠单抗等单药对不同乳腺癌细胞及其干细胞的生长抑制作用;检测BKM120联合多西紫杉醇、BKM120联合曲妥珠单抗对不同乳腺癌细胞和相应干细胞的生长抑制作用,计算药物联合指数。通过划痕实验观察单药和联合用药对不同乳腺癌细胞迁移能力的影响。进一步通过球囊形成实验分析单药和联合用药对不同分子分型乳腺癌细胞系球囊形成能力的影响。利用平板克隆实验检测单药和联合用药对不同分子分型乳腺癌细胞系克隆形成能力的影响,并分析其中的差异。采用免疫蛋白印记方法检测单药和联合用药对不同分子分型乳腺癌细胞及相应乳腺癌干细胞中AKT,pAKT,S6,pS6蛋白水平的影响。 2.体内裸鼠移植瘤实验:成功建立裸鼠乳腺癌干细胞移植瘤动物模型。随机分组条件下,予以单药及联合用药,记录实验期间裸鼠移植瘤体积大小变化和裸鼠体重变化,观察药物在体内对乳腺癌干细胞的影响。 Ispinesib分子重量 结果: 1.BKM120对乳腺癌细胞及干细胞的作用:在体外与对照组相比,BKM120对乳腺癌细胞及干细胞生长均具有一定的抑制作用,干细胞对BKM120具有一定的耐药性。抑制作用呈一定的浓度剂量依赖性。BKM120可以一定程度的降低乳腺癌细胞的迁移能力,减低乳腺癌细胞克隆形成能力,并可以显著的减少乳腺癌细胞的球囊形成,并呈一定的浓度剂量相关。一定作用浓度下,BKM120可以显著的降低乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中pAKT、pS6蛋白水平,并呈一定的浓度剂量依赖性。在体内实验中,一定剂量的BKM120可以抑制裸鼠乳腺癌干细胞移植瘤的增长,而不造成小鼠的体重明显下降。 2.BKM120联合多西紫杉醇对乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞的作用:经过药物联合指数计算,两药联合后呈激动作用。体外实验中与对照组、任一单药组相比,联合用药可进一步的抑制乳腺癌细胞的生长、降低乳腺癌细胞的迁移能力、减少乳腺癌细胞球囊的形成,降低乳腺癌细胞的克隆形成能力。与对照组及单药作用组相比,双药联合组更加明显的降低了乳腺癌细胞中pAKT,pS6等蛋白水平。体内实验中,与对照组及任一单药组相比,联合用药可更有效的遏制乳腺癌干细胞移植瘤的生长,同时未明显降低小鼠的体重。 3.BKM120联合曲妥珠单抗对HER2阳性乳腺癌细胞及相应干细胞的作用:经过药物联合指数计算,两药联合后呈激动作用。体外实验中与对照组、任一单药组相比,联合用药可进一步的抑制乳腺癌细胞的生长、降低乳腺癌细胞的迁移能力、减少乳腺癌细胞球囊的形成,降低乳腺癌细胞的克隆形成能力。与对照组及单药作用组相比,双药联合组更加明显的降低了乳腺癌细胞中pAKT,pS6等蛋白水平。 结论: 1.P13K抑制剂BKM120对乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞生长增殖均产生一定的抑制作用。 2.BKM120联合多西紫杉醇在体内体外对乳腺癌干细胞生长增殖产生一定抑制作用。与单药组相比,联合用药可增强药物抗肿瘤作用,一定程度上克服乳腺癌干细胞对多西紫杉醇的耐药性。 Cell Cycle抑制剂 3.BKM120联合靶向药物曲妥珠单抗在体外对HER2阳性的乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞均产生一定抑制作用。与单药组相比,联合用药可一定程度上增强药物抗肿瘤作用,克服Her2阳性乳腺癌干细胞对曲妥珠单抗的耐药性。目的通过对胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumors, GISTs)患者临床病理特征及术后随访资料的分析,探讨PTEN蛋白表达特点以及Ki-67标记指数与GISTs患者临床病理特点及预后的关系。 方法回顾分析2005年1月至2011年1月在扬州大学临床医学院胃肠外科接受手术治疗的84例原发性GISTs患者的临床病理资料及随访资料。收集GISTs肿瘤组织标本为实验组,收集同期手术的50例GISTs瘤旁正常胃肠道间质组织标本为对照组,制备组织芯片。应用免疫组织化学方法检测PTEN蛋白及Ki-67蛋白的表达水平,并将PTEN蛋白表达特点及Ki-67标记指数与GISTs患者的临床病理特征和无复发生存率(relapse-free survival, RFS)进行分析。 结果GISTs组中PTEN蛋白阴性、弱阳性、阳性、强阳性表达率分别为13.1%、39.3%、44.0%和3.6%,对照组中PTEN蛋白阴性、弱阳性、阳性、强阳性表达率分别为8.0%、20.0%、40.0%和32.0%, GISTs组中PTEN蛋白表达水平低于对照组,差异具有统计学意义(P1%(P=0.043)均与患者5年RFS相关。多因素生存分析结果显示,消化道出血[风险比(hazard ratio,HR)=3.85,95%可信区间(confidence interval,CI):1.63-9.10,P=0.002]、肿瘤大小(HR5.1-10cm.≤5cm=1.86,95%CI:0.67-5.15;HR>10.m.10/50HPFs vs.≤5/50HPFs=3.44,95%CI:1.13-10.45;总体P=0.

9%(P=0 547),统计学分析均无差异(P>0 05)。(2)71例NSCLC患者转移灶组织中EML4-ALK融合基因阳性率在

9%(P=0.547),统计学分析均无差异(P>0.05)。(2)71例NSCLC患者转移灶组织中EML4-ALK融合基因阳性率在吸烟组和不吸烟组分别为3.4%和9.5%;腺癌组和非腺癌组分别为7.4%和5.9%;男性组和女性组分别为7.5%和6.5%;年龄>60岁组和≤60岁组分别为6.7%和7.3%;低分化组和中高分化组分别为6.3%和7.7%;在Ⅲ期和Ⅳ期分别为13.3%和5.4%;统计学分析结果均无差异(P>0.05)。3NSCLC患者组织中EML4-ALK融合基因与血清VEGF含量水平的关系175例NSCLC患者的血清(除去15例配对)VEGF值明显高于参考值上限,并且Ⅰ-Ⅱ期NSCLC患者为177.42±81.88pg/ml, (?)-Ⅳ期为381.74±145.06pg/ml,血清VEGF含量在两组间差异有统计学意义(P0.05)。4 NSCLC患者配对组织中EML4-ALK融合基因的表达一致性15例原发肺组织配对9例淋巴结组织,2例脑组织,2例骨组织、1例胸膜组织和1例体表软组织。15例配对标本中,检测出2例原发肺组织及配对的转移灶组织(胸膜组织1例、骨组织1例)中EML4-ALK融合基因均为阳性,阳性一致率为100%(2/2),余下的13例配对组织中EML4-ALK融合基因均为阴性,阴性一致率亦为100%(13/13)。两例EML4-ALK融合基因阳性患者分别为57岁和71女性、不吸烟、腺癌或含腺癌成分的NSCLC患者。结论1使用qRT-PCR技术能准确反映EML4-ALK融合基因存在状态,NSCLC患者EML4-ALK融合基因总体阳性率为7.4%,原发灶组织和转移灶组织中阳性率分别为8.4%和7.1%,后者略低于原发灶肿瘤组织标本。配对标本结果显示NSCLC原发灶组织和转移灶组织中EML4-ALK融合基因表达情况一致,提示在原发灶肿瘤组织难以获取时,可以对其转移灶肿瘤组织进行检测,为NSCLC患者使用ALK抑制剂提供依据。2 NSCLC患者原发灶肿瘤组织中EML4-ALK融合基因的表达与患者的病理类型和吸烟史有关,主要见于腺癌和不吸烟者,而与患者的性别、年龄、分化程度、分期无明显相关,提示了EML4-ALK融合基因阳性的中国NSCLC患者的临床病理特点。3NSCLC患者血清VEGF含量较参考值明显升高,且与NSCLC分期有关,分期越晚,血清VEGF含量越高。同时该研究结果显示NSCLC患者肿瘤组织中EML4-ALK融合基因阳性与否与血清VEGF含量无明显相关,间接提示了这两条信号通路在NSCLC发生、发展过程中,相互之间关联可能较少。随着计算机技术的高速发展,运用计算机辅助药物设计(CADD)的方法研究开发新型治疗肺癌的药物不仅可以缩短药物研发的周期,而且节省了大量的人力和财力。诺华公司生产的克唑替尼在治疗非小细胞肺癌具有显著的疗效,可以延长患者的生存期。我们参考了克唑替尼的基本结构,利用计算机辅助药物设计的方法分别对36个2-酰基氨基苯并咪唑衍生物以及49个2,4-二芳基氨基吡啶类似物的化合物进行三维定量构效关系(3D-QSAR)研究及蛋白质分子对接(Docking)研究,主要进行了以下五个部分的研究:论文第一章,我们对蛋白质磷酸激酶进行了一个比较详细的阐述,通过各项研究表明ALK蛋白质磷酸激酶的突变对各种重大疾病起着至关重要的作用,具有研究的重大意义。论文的第二章,比较详细的介绍了计算机辅助药物设计的方法,包括三维定量构效模型(3D-QSAR)的建立以及分子对接(Docking),并总结出结论计算机辅助药物设计方法对于ALK磷酸激酶抑制剂的研究以及新型抑制剂分子的设计具有里程碑式的的作用。论文的第三章,介绍了用三维定量构效关系(3D-QSAR)和分子对接(Docking)方法研究简单ALK磷酸激酶抑制剂。ALK磷酸激酶抑制剂对多种重大疾病可以起到良好的作用,ALK已经成为药物研究领域的一个新靶标。本文选用新近发表的生物活性较好的36个2-酰基氨基苯并咪唑衍生物作为研究对象,应用三维定量构效模型关系(3D-QSAR)方法和分子对接(Docking)对ALK磷酸激酶抑制剂的相互作用进行了系统性的研究。研究了化合物的结构与生物活性的关系,利用比较分子立场分析(CoMFA)方法以及比较分子相似性指数分析(CoMSIA)方法建立了两个模型,更好的分析模型的优良性,对于配体具有良好的可预测性。利用3D等高线图以及蛋白质的分子对接(Docking)结果显示,不同的核心配体具有不同的生物活性,可以提高生物活性根据配体结构的不同。利用设计的模型结果进行新分子化合物的设计,选择性的进行合成,筛选,提高生物活性。论文第四章,使用SYBYLX2.0软件对49个2,4-二芳基氨基吡啶类似物化合物进行三维定量构效关系(3D-QSAR)研究及蛋白质分子对接(Docking)研究,用数据阐述模型的可靠性,对后续类似ALK磷酸激酶抑制剂的研究起到至关重要的作用。论文第五章,对于文章的中心思想进行了总结,阐明用计算机辅助药物设计的方法对于ALK磷酸激酶抑制剂的研究具有重大的意义。目的:神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)易复发、预后差,长期生存率低,是最难治的儿童恶性肿瘤之一。传统治疗方法的疗效对于晚期NB患儿已经达到了一个平台期,很难通过提高治疗强度来改善患儿的长期预后。近年来,分子靶向治疗凭借其特异性强、不良反应轻等特点已成为抗肿瘤研究的热点之一。最新的研究显示,酪氨酸激酶受体ALK、ROS1与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。ALK抑制剂克唑替尼已获FDA批准用于治疗ALK重排的非小细胞肺癌。临床前期实验显示,克唑替尼对于ROS1重排的肺腺癌患者也显示了良好的临床应用前景。由此,我们试想以ALK、ROS1为靶点的分子靶向治疗能否应用于神经母细胞瘤的治疗,与传统疗法相结合起到改善患儿预后的效果。本研究的目的在于检测ALK、ROS1蛋白在NB中的表达情况,分析其表达水平与NB的临床病理因素及预后之间的关系,初步探讨二者在NB的组织分化和侵袭转移中的作用,为NB寻找新的用于判断预后的生物标志物,为NB的分子靶向治疗提供新的靶点,以及为酪氨酸激酶抑制剂能否应用于NB的临床治疗提供理论依据。方法:应用免疫组化方法检测ALK、ROS1蛋白在50例NB和18例节细胞神经瘤(Ganglioneuroma,GN)组织中的表达情况,评估两种蛋白的表达与NB的临床病理特征及预后之间的关系。用SPSS JNJ-38877605 价格 MK 2206 IKK-16浓度 17.0统计学软件进行分析。计数资料比较采用χ2检验和Fisher确切概率法;应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,组间生存率的比较用Log-rank检验;多因素分析采用Cox回归分析。P值

p53、MDM2、IGF-1R、βarrestin1在结膜黑色素瘤中的表达及临床意义

目的:检测p53、MDM2、IGF-1R(胰岛素样生长因子1受体,insulin-likegrowthfactor1receptor,IGF-1R)、β-arrestin1四种蛋白在人结膜黑色素瘤肿瘤组织标本中的表达情况,分析以上肿瘤增殖转移相关蛋白阳性表达与性别、年龄、肿瘤病理分型、复发、转移的关系,TGX-221,初步探讨各蛋白作用机制,发现对人结膜黑色素瘤诊断、预后评估具有意义的肿瘤生物学标志蛋白,并指导进一步研究及临床治疗。 方法: 1.收集1980年1月至2012年1月之间,手术切除后病理证实为结膜黑色素瘤的患者中具有详细临床资料和随访记录的肿瘤组织石蜡包埋标本18例。 2.二步法免疫组化检测p53、MDM2、IGF-1R、β-arrestin1在标本中的表达。 3.回顾性分析临床资料,包括患者性别(男性8例,女性10例),年龄(7岁到83岁,平均52.4岁,中位年龄52.5岁,其中60岁以上5例,60岁以下13例)、肿瘤病理分型(上皮细胞型10例,混合细胞型6例,梭形细胞型2例)、局部复发(复发13例,未复发5例)、Decitabine,转移(转移5例,未转移13例)等。 4.免疫组化染色结果与临床资料进行比对分析: ①Fisher精确检验分别对比四种蛋白阳性表达在性别、年龄、复发、转移、病理分型不同分组中有无差异。 ②Spearman等级相关检验p53和MDM2的阳性表达是否相关。 ④Fisher精确检验对比p53和MDM2均阳性表达在性别、年龄、复发、转移、病理分型不同分组中有无差异。 ⑤Spearman等级相关检验IGF-1R和β-arrestin1的阳性表达是否相关。 结果: ①18例人结膜黑色素瘤肿瘤组织标本中,p53在12例肿瘤组织细胞的胞核中阳性表达,阳性表达率66.7%,Fisher精确检验分析p53阳性表达与性别、年龄、复发、转移、均无显著相关(P=1.0、P=1.0、P=0.268、P=0.114),与肿瘤病理分型显著相关(P=0.043);18例人结膜黑色素瘤肿瘤组织标本中,MDM2在12例肿瘤组织细胞的胞核中阳性表达,阳性表达率66.7%,Fisher精确检验分析MDM2阳性表达与性别、年龄、复发、转移、均无显著相关(P=1.0、P=0.615、P=1.0、P=0.114),与肿瘤病理分型显著相关(P=0.043);18例人结膜黑色素瘤肿瘤组织标本中,p53和MDM2在10例肿瘤组织细胞的胞核中同时阳性表达,阳性表达率55.6%,Fisher精确检验分析p53和MDM2同时阳性表达与性别、Carboplatin,年龄、病理分型、肿瘤复发均无显著相关(P=1.0、P=1.0、P=0.054、P=0.068),与肿瘤转移显著相关(P=0.036)。 ②Spearman等级相关检验p53和MDM2的阳性表达之间存在正相关(rs=0.5,P=0.035)。 ③18例人结膜黑色素瘤肿瘤组织标本中,IGF-1R在10例肿瘤组织细胞的胞浆中阳性表达,阳性表达率55.6%,Fisher精确检验分析IGF-1R阳性表达与性别、年龄、病理分型均无显著相关(P=1.0、P=0.608、P=0.054),与肿瘤复发、转移显著相关(P=0.007、P=0.036)。 ④18例人结膜黑色素瘤肿瘤组织标本中,β-arrestin1在5例肿瘤组织细胞的胞浆中阳性表达,阳性表达率27.8%,Fisher精确检验分析β-arrestin1阳性表达与性别、年龄、肿瘤复发、转移、病理分型均无显著相关(P=0.118、P=1.0、P=0.583、P=0.249、P=0.608)。 ⑤Spearman等级相关检验IGF-1R和β-arrestin1的阳性表达之间无相关性(P=0.440)。 结论: 1、p53、MDM2在人结膜黑色素瘤肿瘤组织标本中均有阳性表达。p53、MDM2阳性表达增高时肿瘤恶性程度高,预后较差。二者的表达相互影响,同时表达时对判断预后有一定意义。靶向阻断二者共同作用通路可能抑制肿瘤的发生。 2、IGF-1R在人结膜黑色素瘤肿瘤组织标本中有阳性表达,且IGF-1R阳性表达增高与肿瘤的复发转移有关。IGF-1R通过多种机制实现正性调控肿瘤作用,表达对评估预后、指导治疗有一定意义。 3、β-arrestin1在人结膜黑色素瘤肿瘤组织标本中有阳性表达,但阳性表达与各指标均不相关,在人结膜黑色素瘤中的作用和机制尚不明确。

多倍体肿瘤的发生与耐药的相关性研究

恶性肿瘤严重威胁人类健康,化疗作为恶性肿瘤综合治疗中必不可少的方法,在临床治疗中发挥着重要作用。纺锤丝毒性药物(如紫杉醇、多西他赛等)是妇科肿瘤治疗中常用的一线化疗药物。在临床工作中我们观察到:在化疗初始阶段,肿瘤一般对所用药物敏感,但在随后的不同阶段多数肿瘤会出现耐药、复发,还有部分肿瘤甚至在初始治疗的过程中就出现耐药。 肿瘤耐药的机制是复杂多样的,关于纺锤丝毒性药物的耐药机制的研究目前多集中在多药耐药基因与肿瘤耐药的关系方面。U0126,课题组前期研究发现:在体外培养中,有些肿瘤细胞在接受纺锤丝毒性药物治疗过程中除部分以凋亡告终外,还有部分肿瘤细胞并不表现为凋亡现象,而是以形成多倍体(四倍体甚至八倍体)细胞为特征;这些多倍体肿瘤细胞不仅没有被化疗药物所杀灭,反而在短暂调整后继续进行DNA的复制,他们不但可以长期存在,同时表现出了对多种不同作用机制的药物更强的耐药性,我们推测,这些化疗筛选后的“幸存者”是肿瘤耐药、复发的根源之一。国外的一些研究也报道了相似的结果:多倍体肿瘤细胞具有高度的遗传不稳定性,对放化疗均极不敏感,具有多倍体亚克隆的肿瘤预后更差。因此我们提出“纺锤丝毒性药物诱导形成的多倍体肿瘤是耐药的重要表现或又一重要机制”这一假说。 课题的前期研究初步探讨了多倍体肿瘤细胞发生凋亡逃逸及耐药的可能机制,发现:在纺锤丝毒性药物诱导产生多倍体肿瘤细胞过程中,凋亡通路的异常,特别是抗凋亡基因Bcl-2的异常表达起着重要的作用;在多倍体耐药中,同样发现Bcl-2的异常表达起着重要的调控作用。作为纺锤丝毒性药物发挥细胞杀伤作用的主要途径,凋亡通路上各调控点的正常运作起着至关重要的作用。有实验表明,Bcl-2作为凋亡的各种信号转导途径的共同通路或交汇点,可增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性,抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞凋亡。这与我们的实验结果一致,因此提示:抗凋亡基因Bcl-2的高表达在多倍体肿瘤形成及耐药过程中的调控作用,很可能成为后续研究对抗多倍体耐药的重要切入点。 那么临床中,经紫杉醇等纺锤丝毒性药物治疗后耐药、复发的肿瘤是否也出现上述变化——形成多倍体?本研究拟通过临床肿瘤组织实验,进一步探讨经纺锤丝毒性药物治疗后肿瘤DNA倍体的变化(多倍体肿瘤的形成)与耐药发生的关系,Barasertib,及抗凋亡基因Bcl-2的表达在多倍体肿瘤的形成及耐药发生中的意义。 方法: 收集15例临床经纺锤丝毒性药物治疗前后的同一患者的肿瘤组织病理(包括复发耐药及正在进行新辅助化疗的两类患者),应用荧光原位杂交技术检测经纺锤丝毒性药物治疗前、后DNA倍体的改变情况,同时,应用免疫组织化学法检测化疗前、后组织中抗凋亡基因Bcl-2的表达情况。 结果: 1、复发耐药肿瘤中DNA倍体的改变与Bcl-2的表达情况 复发耐药组共9例,与化疗前相比,复发耐药后肿瘤组织中多倍体细胞数目的增加具有统计学意义(P=0.001);Bcl-2在耐药组织中的表达较化疗前明显升高,且与多倍体细胞数目的增加具有显著的正相关关系(r=0.791,P

人体MDM2蛋白的重组表达,纯化及鉴定研究

MDM2(Murinedoubleminute2)是RING(Reallyinterestingnewgene)型泛素蛋白连接酶的重要成员之一。它最主要的生理功能是负调控抑癌蛋白p53,通过与p53的直接结合抑制p53转录因子活性,Dorsomorphin,促进p53泛素化修饰、降解及其出核移位过程。MDM2是p53最重要的抑制因子,通过多种分子机制调控p53的稳定性及生物功能,其过程及具体机制繁多且复杂。MDM2蛋白主要由N端到C端有四个功能区构成,其中氨基端的19-110氨基酸的I区可以使MDM2与p53基因紧密结合;200-280高度酸性区域的II区可以与核糖体15蛋白及5srRNA相互结合;300-330氨基酸区域的III区则含有一个锌指结构;438-491氨基酸的IV区包含一个环指结构,参与各种蛋白质之间的作用。MDM2既能通过与p53直接结合来抑制p53转录因子活性,同时也能利用其非p53依赖途径而发挥致癌作用。有研究显示,在p53缺失的条件下,mdm2的转基因小鼠也容易自发性形成肿瘤。在至少百分之七的肿瘤中,p53基因是正常的而mdm2基因却异常扩增。同时,在肿瘤及正常组织中,BIIB057,至少已鉴定出40多种不同的mdm2剪接体,而其中大多数剪接体都不含有p53结合区,表明MDM2癌基因活性的发挥另外存在某种不依赖于p53的其他途径。MDM2通过对一系列底物分子蛋白稳定性的调控作用,参与调节基因组的稳定性、细胞周期、细胞分化及DNA损伤修复等多种生物学过程。MDM2作为联系肿瘤发生与泛素蛋白酶体系统的重要蛋白,无疑是未来相关药物研发的富有前景的靶标之一。本论文利用大肠杆菌SUMO表达系统制备了人体MDM2蛋白,并对该蛋白进行了纯化和鉴定研究。我们发现一步纯化可使MDM2蛋白达到90%的纯度;我们在对MDM2鉴定的过程中发现,MDM2蛋白aa368-aa429的氨基酸序列中,其中六个磷酸化位点的突变对MDM2蛋白泛素化功能的发挥起到了重要的作用,但该突变对MDM2蛋白的表达却影响不大。MDM2蛋白C端结构域在其结构和功能上发挥着重要的作用。为了更好地研究MDM2蛋白及其结构域特性,我们创新性地将MDM2蛋白C端300-491位氨基酸(CTD,CTerminalDomain,包括ZincFinger结构域和RING结构域)进行单独地重组构建,纯化和鉴定。Akt inhibitor,利用大肠杆菌SUMO表达系统获得了大量的融合蛋白,并通过Ni-NTA亲和纯化和ULP1酶切获得纯化率为90%的CTD蛋白。目的蛋白接下来可通过硫酸铵沉淀大幅度提高纯化程度并保持稳定。离子交换显示CTD蛋白仍保留结合DNA的能力,因此,在细胞悬液中加入DNASE可有效去除DNA并提高亲和纯化步骤的蛋白产率。我们最后利用Superdex75型号的分子筛对目的蛋白进行鉴定,其蛋白洗脱峰位置对应的蛋白分子量大小在35-43kDa之间,与其在SDS-PAGE上鉴定的分子量大小一致,说明我们表达的CTD蛋白是单体结构。最终CTD蛋白纯化率为95%,产量为2mg/L。本论文创新重组表达了MDM2蛋白及其重要的CTD结构域,并找到了简捷高效纯化该目的蛋白的方法,为以后的结构及晶体研究打下坚实基础。之前的研究发现MDM2全长和其C端RING结构域本身会形成同源或异源二聚体,并且RING本身也难以纯化,因此,在本研究中,我们得到的CTD蛋白,通过将RING结构域与其上游结构域Zincfinger一起表达纯化而得到的单体结构,为MDM2非p53依赖途径的研究提供了新的思路。

阿霉素耐药Raji细胞株的建立与Prohibitin及微小RNA-27a的表达情况分析

研究背景:非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma,NHL)是起源于淋巴结和淋巴组织的免疫系统恶性肿瘤,其发生大多与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化产生的某种免疫细胞恶变有关。NHL可分为B细胞性和T细胞性,其中B细胞性占大多部分,包括弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、Bukitt淋巴瘤(BL)等。Seliciclib,目前,联合化疗CHOP(环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+强的松)方案仍是治疗大多数NHL患者的主要措施。然而,随着化疗药物的广泛应用,NHL多药耐药(MDR)性问题已成为治疗失败的一个重要原因。已知肿瘤MDR机制复杂,涉及多种耐药相关基因及其耐药相关蛋白表达的改变以及多种信号通路的激活,其产生的机制可能有:药物外排增加、细胞凋亡调节障碍、药物作用靶标改变、DNA损伤修复功能增强、药物代谢动力学改变等。因此,研究针对MDR相关基因、蛋白与信号通路的靶向药物和开发有效的多药耐药逆转剂已成为近年来国内外学者的研究热点。阿霉素(ADR)是一种经典的蒽环类抗生素,能嵌入DNA碱基对之间,并紧密结合到DNA上,阻止RNA转录过程,抑制RNA合成,也能阻止DNA复制,属于细胞周期非特异性药物。ADR抗瘤谱广,疗效高,是NHL联合化疗CHOP方案的重要药物。然而,ADR相关的心脏毒性反应和化学耐药性严重限制了其在NHL中的治疗效果,成为NHL治疗失败的一个重要原因。XAV-939,Burkitt淋巴瘤是一种高度侵袭性的NHL,目前临床治疗效果仍不理想,其体外建立的Burkitt淋巴瘤细胞系——Raji,一直以来被广泛应用于人B细胞淋巴瘤的研究中。通过建立一株体外ADR诱导的Raji耐药细胞株,进而寻找Raji耐药株与敏感株之间的差异表达基因与蛋白,从而发现与NHL耐药相关的新的靶标基因,将为进一步认识NHL耐药机制并探索有效的多药耐药逆转剂,最终战胜NHL临床耐药性难题提供有力支持。Prohibitin(PHB)是一类进化上高度保守,广泛存在于各种生物细胞中的蛋白,PHB基因家族可定位于线粒体、细胞核及细胞膜,其在细胞内的不同定位决定了它具有多样的生物学功能。人类PHB1和PHB2聚合形成高分子量环状复合体,主要定位于线粒体内膜,在维持线粒体呼吸链酶复合体及其形态和功能稳定性中发挥重要作用。目前在急性淋巴细胞白血病、卵巢癌、前列腺癌等多种人类恶性肿瘤中证实PHB通过调控线粒体膜功能在细胞抗凋亡中起保护性作用,从而在耐药机制中发挥重要作用。我们的前期研究亦发现,ADR处理Raji细胞后线粒体PHB表达上调,应用P13K/AKT通路抑制剂可以下调PHB的表达,并增加Raji细胞对ADR的化疗敏感性。由此我们推测PHB可能是与NHL多药耐药性的发生密切相关的一个靶标基因。Flavopiridol,微小RNA(miRNA)是广泛存在于真核生物中由20-23个核苷酸组成的的单链小分子RNA,通过抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA两种方式在转录后水平调节基因的表达,参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学功能的调控,从而影响疾病的发生发展,成为潜在的治疗靶标及新的分子生物学标志物。miRNA在肿瘤细胞MDR中的作用已日益引起了国内外关注,而大量研究也已证实,多种miRNAs在NHL细胞中存在表达水平的改变,通过调节不同靶标基因蛋白的表达,调控淋巴细胞的分化、发育与凋亡,进而影响NHL的诊疗和预后。以miRNA作为切入点设计基因药物将为NHL的靶向基因治疗,改善NHL细胞耐药性开辟一条新的途径。研究发现,微小RNA-27a(miR-27a)在多种肿瘤中高表达,并发挥原癌基因的作用。此外,miR-27a高表达还与急性白血病、卵巢癌、胃癌、食管癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤细胞多药耐药的发生密切相关,其表达水平的改变可通过改变多药耐药基因的表达水平在白血病、胃癌及食管癌细胞对多柔比星的药物抵抗中发挥重要作用。因此,我们推测miR-27a可能是参与NHL多药耐药机制的另一个重要靶标基因。目前国内外还未见PHB与miR-27a与NHL多药耐药性相关的报道。本研究中,我们通过建立ADR耐药的Raji细胞株,并检测ADR耐药细胞株及其敏感株中PHB及miR-27a的表达水平差异,从线粒体蛋白及miRNA的角度阐述与ADR作用密切相关的新的NHL耐药分子靶标,为逆转NHL细胞多药耐药提供新的治疗靶点。研究目的:建立阿霉素(ADR)耐药Raji细胞株,并检测Prohibitin(PHB)及微小RNA-27a(miR-27a)在耐药细胞株(Raji/A)及敏感细胞株(Raji/S)中的表达差异并探讨其临床意义。研究方法:建立Raji/A细胞株,相差显微镜观察细胞一般形态及生长特性并计数,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Raji/A及Raji/S细胞中miR-27a与PHB基因mRNA的表达水平,Westernblot检测PHB1蛋白在Raji/A及Raji/S细胞线粒体中的表达。研究结果:建立了Raji/A细胞株,其一般形态及生长特性与Raji/S细胞株相比出现差异,增殖速度减慢,耐药倍数为306.47倍,对长春新碱(VCR)、高三尖杉酯碱(HHT)存在交叉耐药,耐药倍数分别为3.44倍和2.88倍,对甲氨蝶呤(MTX)无交叉耐药性,脱药培养1个月仍保持耐药性,经ADR处理后凋亡明显减少。miR-27a在Raji/A细胞中的表达明显高于Raji/S细胞,为(128.40±31.59)倍(P

红景天苷对Aβ1-40所致AD模型大鼠海马NADPH氧化酶-ROS通路的影响

目的:NADPH氧化酶是组织细胞内ROS产物的主要来源。本部分实验通过观察NADPH氧化酶家族成员亚基的的表达与激活,对红景天苷是否可以抑制AD模型大鼠海马组织细胞内ROS产生的上游通路的潜在机制进行探讨。 方法:采用Aβ1-40海马内注射制备AD大鼠模型,CFTR inhibitor,术后给予已定量的红景天苷(50mg•kg-1•d-1)灌胃治疗,每日1次共21天。建立模型成功后,采用RT-PCR技术和Westernblot技术检测大鼠海马组织中gp91phox及其他亚基在mRNA和蛋白水平的表达。数据用ˉx±s表示,用SPSS16.0统计分析软件进行统计学数据分析,采用方差分析及LSD进行组间比较及两组间比较,以P

红景天苷对Aβ1-40所致AD模型大鼠氧化应激及凋亡的影响

目的:氧化应激反应是不同刺激因素所诱发神经细胞损伤及多种中枢神经功能退行性紊乱疾病的共同通路。Aβ1-40能通过不同途径激发脑组织细胞内的氧化应激反应,进而产生大量ROS。Tubastatin A,本部分实验研究通过检测红景天苷对Aβ1-40所导致AD实验模型大鼠海马组织细胞内总ROS生成、血清及海马组织细胞内SOD活性、血清及海马组织细胞内MDA含量来深入研究探讨红景天苷对Aβ1-40所致AD模型大鼠脑内氧化应激损伤的影响。 方法:Aβ1-40海马内注射制备AD实验大鼠模型,术后给予已定量红景天苷(50mg•kg-1•d-1)灌胃治疗,每日1次共21天。建立模型成功后,采用DCFH-DA作为荧光检测探针,采用流式细胞技术测定AD实验模型大鼠海马组织细胞内总ROS生成,Adenosine Receptor拮抗剂,氧化酶法测定AD大鼠模型血清及海马组织细胞内SOD活性,采用硫代巴比妥酸法检测大鼠血清及海马组织细胞内MDA的含量。数据用ˉx±s表示,用SPSS16.0统计分析软件进行统计学数据分析,用方差分析及LSD进行组间比较和两组间比较,以P