Monthly Archive: October 2016

P53-靶向小分子Rita对宫颈癌原代细胞体外放射增敏的初步研究

目的: 建立稳定的宫颈癌体外原代细胞,用P53靶向小分子药Rita进行体外细胞放射增敏实验,为临床放疗的发展提供理论指导,为建立p53靶向小分子辅助宫颈癌放疗的提供新策略。 方法: 本实验分为两部分:第一部分为肿瘤组织的体外培养及鉴定,Miltefosine,包括:(1)形态学观察:倒置显微镜下观察细胞的形态,看是否具有肿瘤细胞的形态学特点。(2)组织来源:通过免疫细胞化学鉴定细胞角蛋白来判断细胞是否符合来源于上皮组织。(3)端粒酶活性测定:通过测得细胞端粒酶的活性来判断培养的细胞为癌细胞。(4)HPV-E6的测定:通过测得宫颈癌特有标志蛋白HPV-E6来判断培养的细胞为宫颈癌细胞(5)细胞生长特性:采用MTT法绘制细胞的生长曲线。第二部分应用MTT法测定不同时间、不同浓度Rita对宫颈癌细胞的增殖抑制作用,求出半数抑制浓度(IC50)。Linsitinib,将宫颈癌细胞分为:空白对照组、照射组、药物组、药物与照射联合组,应用CCK-8法研究Rita与放射联合效应,利用“多靶单击”数学模型拟合生物存活曲线,获得平均致死剂量、准阈剂量、放射增敏比(SER)等参数,进行效应评估。将宫颈癌细胞分为:空白对照组、照射组、药物组、药物与照射联合组.Rita作用细胞48h后,流式细胞术分析细胞凋亡率的变化。 结果: 宫颈癌细胞在体外培养初步成功。倒置显微镜下观察细胞呈梭形及不规则多角形,TW-37,有聚集生长趋势;符合癌细胞的形态学特征;细胞角蛋白鉴定胞浆黄染,CK阳性,证明癌细胞起源于上皮组织,细胞端粒酶活性及HPV-E6检测阳性,可诊断为宫颈癌细胞。Rita作用后宫颈癌细胞生长增殖受到抑制,浓度高细胞抑制率大,时间长细胞存活率低,作用48小时IC50为18.5umol/L,IC20为7.5umol/L。Rita作用宫颈癌细胞48h后联合放射的放射增敏比(SER)>1。Rita作用宫颈癌细胞后流式细胞仪检测,其药物组和放射组凋亡率较对照组细胞升高,分别为10.397±0.264,14.497±0.836.而联合组中,凋亡率升高更为显著,可达20.377±1.116。比较差异均有统计学意义(P

肾透明细胞癌组织中miR-34a和miR-34b/c基因CpG岛甲基化水平的变化及意义

目的:采用RT-PCR的方法检测miR-34a和miR-34b/c基因CpG岛甲基化在肾透明细胞癌组织与癌旁正常肾组织中的表达水平,SB431542,并结合肾癌的TNM分期分析其表达水平间的差异及其意义,从而为进一步研究其功能及作用机制做准备。 方法:提取30例行手术治疗的肾透明细胞癌患者的肾癌组织和癌旁正常组织(距离肿瘤边缘>5cm)中的DNAs,MK-2206,按是否有淋巴结转移,分为A,B两组各15例,A组为无淋巴结转移,B组为有淋巴结转移。两组组织经甲基化处理后,用PCR的方法检测]miR-34a和miR-34b/c基因CpG岛甲基化水平在两组肾癌组织和癌旁正常组织中的表达情况,结合肾癌的TNM分期进行统计分析,探讨其表达水平间的差异及其意义。 结果:电泳结果显示,miRNA-34a和miR-34b/c基因成单一条带,其所处的位置及其在正常组织和癌组织中的甲基化情况符合前期的预计。miR-34a和miR-34b/c基因CpG岛甲基化水平如下:A组肾癌组织中miR-34a4/15(26.7%),miR-34b/c15/15(100%),癌旁正常组织均为0;B组肾癌组织中miR-34a13/15(86.7%),miR-34b/c15/15(100%),癌旁正常组织均为0。miR-34a和miR-34b/c基因CpG岛甲基化水平在肾癌组织中明显增高;Vismodegib,miR-34a基因CpG岛甲基化水平,伴有淋巴结转移的肾癌组织中13/15(86.7%)明显高于无淋巴结转移的肾癌组织4/15(26.7%)(P

Nutlin-3a诱导的p73α对结肠癌细胞周期阻滞的作用及其作用机制

目的:本项目研究不同剂量Nutlin-3a对内源性p73α表达及功能的影响,Trichostatin A,,探讨由此产生的对结肠癌细胞老化和静止的作用及其作用机制,为Nutlin-3a用于p53突变及p53缺失的结肠癌的治疗、减少此癌复发的可能性提供实验依据。 方法:人体结肠癌细胞株Caco-2(p53基因突变,含野生型p73α基因),用10%胎牛血清DMEM培养基培养于5%CO2、37°C的潮湿环境中24h。用含0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM及80μM的Nutlin-3a培养液培养Caco-2细胞72h后,用MTT法检测Nutlin-3a对Caco-2细胞的抑制作用;WesternBlot检测p73α蛋白在Caco-2细胞中的表达;MS-275,SA-β-gal染色标识出老化的Caco-2细胞;细胞集落形成分析检测Caco-2细胞在Nutlin-3a撤药后是否重新增殖。寻找一个浓度范围的Nutlin-3a所诱导的p73α能引起癌细胞死亡(凋亡及有丝分裂死亡)及老化,但不引起癌细胞静止,而使肿瘤在化疗药物撤除后复发的可能性减少,并探索Nutlin-3a引起上述结果的作用机制。 结果:Nutlin-3a能抑制Caco-2细胞的生长;Nutlin-3a可以上调p73α蛋白在Caco-2细胞中的表达,且有浓度依赖效应;Nutlin-3a引起结肠癌老化但不引起其静止的最佳浓度范围是5-10μM。 结论:Nutlin-3a可以使P73α蛋白在Caco-2细胞中的表达加强,且有浓度依赖效应。当Nutlin-3a的浓度为5-10μM时,Nutlin-3a对结肠癌细胞Caco-2的抗肿瘤效应最好。 目的 应用细胞外源基因转染和免疫缺陷鼠乳腺癌移植模型,Nutlin-3,探讨活体内14-3-3σ对乳腺癌的抑制作用。 方法 采用不同浓度的14-3-3σ转染乳腺癌MCF-7细胞,构建裸鼠乳腺癌移植瘤模型。调节浓度为2×10~6,以裸鼠腋下作为注射点,分别皮下注射0.2ml。采用免疫组织化学法和Westernbolt技术检测各组瘤组织中CyclinB1、CDK4蛋白的表达,TUNEL法检测裸细胞凋亡情况。 结果 (1)18只裸鼠皮下移植瘤明显,三组裸鼠成瘤率均为100%,连续四周测量三组裸鼠的成瘤体积,可见高表达组瘤体最小,裸鼠瘤体体积明显小于空白对照组和阴性对照组。结果分别为873.56±19.86mm~3、2405.61±67.44mm~3和2563.27±73.68mm~3,实验组与对照组两两比较裸鼠成瘤体积差异具有统计学意义(P

2-吡咯酮衍生物HL-5201的合成及药理活性研究

目的: 通过“一锅煮”多组分反应(MCRs)合成2-吡咯烷酮类衍生物HL-5201,并探讨HL-5201的抗炎免疫等相关药理活性。方法: 1)以丁炔二酸二乙酯、环己胺、2-氨基吡啶和甲醛为原料,冰醋酸为催化剂,在乙醇溶剂中,采用“一锅煮”四组分反应合成2-吡咯烷酮类衍生物HL-5201,采用薄层色谱法(TLC)监测反应的进行,通过硅胶柱层析或重结晶法对粗产物进行分离纯化。通过质谱(MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)分析确认HL-5201的结构。通过改变不同组分的摩尔比、反应溶剂种类、投料方法和反应温度等条件,ZD1839,对反应条件进行优化。 2)常规制备小鼠腹腔巨噬细胞,建立LPS(10μg/ml)刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮(NO)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-a)等炎症因子实验模型。采用格里斯试剂(Griess)检测HL-5201对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的影响;通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测HL-5201对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-a的影响。评价HL-5201体外抗炎活性。采用二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀,建立小鼠急性炎症模型,观察HL-5201对小鼠耳廓肿胀度的影响,评价HL-5201的体内抗炎活性。 3)采用醋酸诱导小鼠扭体反应和热板致痛实验模型,观察HL-5201的镇痛活性。 4)常规制备小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠脾细胞,采用MTT法检测HL-5201对正常小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞的代谢活力的影响;并通过PI3K、P38MAPK、JAK-2等信号通路阻断剂、蛋白酶体或基因转录抑制剂,研究HL-5201影响小鼠腹腔巨噬细胞代谢活力的可能作用机理。采用中性红法检测HL-5201对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。常规制备小鼠脾细胞,利用脂多糖(LPS,10μg/ml)或刀豆蛋白(ConA,4μg/ml)分别诱导小鼠脾细胞增殖,采用MTT法观察HL-5201对小鼠脾细胞增殖反应的影响。 5)通过小鼠尾静脉注射印度墨汁,建立小鼠碳粒廓清实验模型,观察HL-5201对小鼠非特异性免疫功能的影响。以兔红细胞为抗原,豚鼠血清制作补体,建立小鼠体液免疫反应模型,检测HL-5201对小鼠血清溶血素水平的影响,评价HL-5201对小鼠体液免疫功能的影响。以二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发型超敏反应,并分离其脾脏和胸腺,观察HL-5201对小鼠耳廓肿胀度、Rapamycin,脾脏指数和胸腺指数的影响,评价HL-5201对细胞免疫功能的影响。 6)采用MTT法检测HL-5201对S180肿瘤细胞体外增殖的影响。抽取S180腹水,接种于小鼠前肢腋下,建立S180荷瘤小鼠动物模型,观察HL-5201对S180荷瘤小鼠肿瘤的影响。 结果: 1)合成反应在3h内完成,目标产物(HL-5201)以白色结晶或固体从溶剂中析出,采用硅胶柱层析法(流动相:正己烷:乙酸乙酯=6-1:1)或重结晶法可对产物进行分离纯化。产物经MS、1H-NMR和13C-NMR确证结构(化学名:N-(2-吡啶基)-4-环己氨基-5-氧代-2,5-二氢-3-吡咯甲酸乙酯)。通过对反应条件的优化,得到最佳反应条件(各组分摩尔比:丁炔二酸二乙酯:环己胺:2-氨基吡啶:甲醛:冰醋酸=1:1:1:3:2;溶剂:无水乙醇;投料方式:丁炔二酸二乙酯与环己胺在乙醇中预先反应10min,再加入2-氨基吡啶、甲醛与冰醋酸的混合液;反应温度:室温)。在该反应条件下,产率可达81.2%。 2)LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌炎症因子(NO、IL-1β、IL-6、TNF-α)实验中,与空白对照组相比,LPS(10μg/ml)能显著刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO、IL-1β、IL-6和TNF-α(P=0.000、P=0.000、P=0.000、P=0.000);与LPS组相比,HL-5201能有效抑制LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生NO,浓度为60μmol/L时的抑制效果最佳(P=0.000),抑制率达到52.5%,与地塞米松(1μmol/L)相当。HL-5201能明显抑制LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1β(P=0.000),在浓度为60μmol/L时,抑制率为60.9%。HL-5201在浓度为60μmol/L时明显抑制LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-6(P=0.004),抑制率为33.7%。相反,HL-5201在浓度为60、30μmol/L时,明显促进LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α,与LPS组比有显著性差异(P=0.000、P=0.000)。二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀试验中,HL-5201对二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀无影响,与模型对照组相比无显著性差异。 3)镇痛实验中,HL-5201对醋酸所致小鼠扭体反应次数和热板致痛实验中小鼠的痛阈值均无影响,NSC683864,与模型对照组比较无显著性差异。 4)MTT法检测小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞代谢活力实验中,与空白对照组相比,HL-5201能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞代谢活力,且增强作用呈一定的剂量依赖关系,在浓度为30μmol/L时达到最大效应(P=0.000)。H89(0.1μmol/L)、BAY11-7082(0.1μmol/L)和AG490(100μmol/L)对HL-5201(30μmol/L)促进小鼠巨噬细胞或脾细胞代谢活力无影响;ActinomycinD(0.1pg/ml)、Wortmannin(10μmol/L)、SB203580(10μmol/L)、MG132(0.05μmol/L)、LY294002(5μmol/L)和Genistein(10μmol/L)能明显阻断HL-5201促进小鼠巨噬细胞或脾细胞代谢活力。HL-5201能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬中性红能力,与空白对照组相比有显著性差异(P值均小于0.01)。LPS或ConA诱导小鼠脾细胞增殖实验中,与空白对照组相比,LPS(10μg/ml)和ConA(4μg/ml)能显著刺激小鼠脾细胞增殖(P=0.000);与LPS组或ConA组相比,HL-5201在浓度为60、30μmol/L时均能显著抑制LPS或ConA刺激小鼠脾细胞增殖反应(P=0.000、P=0.000);当浓度降为15μmol/L以下时,HL-5201对LPS或ConA刺激小鼠脾细胞增殖反应的抑制效应消失,OD值接近LPS组或稍高。 5)小鼠碳粒廓清实验中,HL-5201高剂量(100mg/kg)灌胃给药时能明显提高小鼠的校正吞噬指数,与空白对照组相比有显著性差异(P=0.010)。二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发型超敏反应实验中,HL-5201对小鼠耳廓肿胀度无影响,与模型对照组比较无显著性差异。血清溶血素实验中,HL-5201对小鼠血清溶血素水平无影响,与模型对照组无显著性差异。 6)观察对肿瘤的影响实验中,HL-5201在浓度为7.5-60μmol/L时促进S180肿瘤细胞增殖,与空白对照组相比有显著性差异(P值均小于0.05)。与模型组相比,HL-5201高剂量(100mg/kg)灌胃给药时促进S180荷瘤小鼠的肿瘤的增长(P=0.016)。 结论: 1)以丁炔二酸二乙酯、环己胺、2-氨基吡啶和甲醛等原料通过多组分反应,经历多米诺氢胺化、aza-en类型反应和酰胺化-环化等过程合成了2-吡咯烷酮衍生物HL-5201,产物HL-5201可经硅胶柱层析(流动相:正己烷:乙酸乙酯=6~1:1)或重结晶法分离纯化。该法具有操作简单、反应条件温和、产率高等优点。 2)HL-5201能有效抑制LPS刺激腹腔巨噬细胞产生NO、IL-1β和IL-6,对二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀无抑制作用。提示HL-5201在体外有明显的抗炎活性,而在体内无抗炎活性。 3)HL-5201对醋酸致小鼠扭体反应次数和热板致痛实验中小鼠痛阈值均无影响,提示HL-5201无镇痛活性。 4)HL-5201能显著促进小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞代谢活力,提示该化合物具有一定的免疫促进活性。HL-5201促进细胞代谢可能通过多环节作用,如通过激活PI3K、P38MAPK等信号通路或激活蛋白激酶等途径。HL-5201能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。HL-5201高浓度(60、30μmol/L)时均抑制LPS或ConA刺激小鼠脾细胞增殖反应,而低浓度(3.25~15μmol/L)对LPS或ConA刺激增殖反应却有稍微的促进作用,提示HL-5201高剂量可能具有免疫抑制活性,而在低剂量时却显示免疫促进活性,具体机制有待进一步深入研究。 5)HL-5201在剂量为100mg/kg时能明显提高小鼠的校正吞噬指数;HL-5201对DNFB致小鼠耳廓肿胀和小鼠血清溶血素水平无影响。提示HL-5201能提高小鼠非特异性免疫功能,其机制可能与促进免疫细胞(如巨噬细胞或脾细胞)代谢活力有关,而对小鼠细胞免疫或体液免疫无影响。 6)HL-5201体外促进S180细胞代谢或增殖,体内促进肿瘤的增长。此实验现象或与HL-5201促进细胞代谢或增殖活性相关,这一有趣的现象和具体机制有待进一步研究。

大乳头水螅原癌基因c-Myc的克隆、生物信息学分析及原核表达

原癌基因是参与细胞生长、细胞分裂和细胞分化的正常基因,但当其发生突变后就会变成致癌基因。目前已经已发现100余种原癌基因,其中核酸转录因子c-Myc是许多癌症的致病因子之一。Pfizer授权分子库,基于2010年完成的低等无脊椎动物水螅基因组计划得到的DNA序列数据进行理论推导,发现水螅具有原癌基因c-Myc类似基因。水螅的原癌基因c-Myc是否也能像高等动物c-Myc一样可以转变为癌基因?水螅的原癌基因c-Myc确切的生理功能是什么?c-Myc在水螅体内的表达是否与水螅较强的再生能力相关?这些疑问亟待解答。鉴于此,我们围绕大乳头水螅c-Myc基因cDNA序列的克隆开展了如下研究工作: 1.运用SMART技术构建了大乳头水螅SMARTRACEcDNA文库,通过RT-PCR方法克隆了大乳头水螅c-Myc基因cDNA序列。PI3K Inhibitor Library大乳头水螅c-Myc基因cDNA序列编码区核酸序列全长945bp,编码314个氨基酸,c-Myc蛋白分子由转录激活区和HLH(helixloophelixdomain)结构域两部分构成。本研究成功克隆大乳头水螅c-Myc基因cDNA序列为深入探讨水螅c-Myc的功能及系统进化奠定基础。 2.依据大乳头水螅c-Myc基因cDNA序列及原核表达质粒pET-LT多克隆位点的特征设计引物,采用PCR方法扩增出带有特殊酶切位点的c-Myc基因cDNA序列,经BamHI和EcoRI双酶切后定向克隆到原核表达质粒pET-LT中,构建原核表达质粒pET-LT-c-Myc,ABT-888,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达产物经SDS-PAGE检测表明,在大肠杆菌中成功表达了重组c-Myc蛋白。重组c-Myc蛋白的成功表达有助于揭示水螅c-Myc蛋白的生理功能及制备c-Myc蛋白抗体等后续工作的开展。

DEK表达对结肠癌细胞HCT116增殖的影响

背景 结肠癌发病率呈逐年升高趋势,且患者发病隐匿,临床上确诊时多为中晚期,约40%的患者虽经手术、放化疗等综合治疗仍预后不良,发生肿瘤耐药、进展或复发。研究表明,DEK基因在多种恶性肿瘤中均过表达,并且与肿瘤的发生发展及化疗耐药机制有密切关联,因此,DEK基因很有可能成为肿瘤生物治疗的新靶点。然而,DEK在结肠癌细胞中的作用及机制如何,国内外相关文献报道甚少。Wee1 抑制剂,本实验以人结肠癌细胞系HCT116为主要研究对象,观察通过慢病毒改变细胞内DEK表达水平对细胞增殖、克隆形成及细胞周期等相关生物学特性的影响,初步研究DEK作为结肠癌潜在治疗靶点的可能性。 目的 通过构建携带针对DEK的shRNA载体及过表达载体,包装慢病毒,感染结肠癌细胞系HCT116,改变细胞内DEK基因的表达水平,研究DEK基因对细胞增殖、细胞周期及克隆形成能力的影响,为探索DEK作为结肠癌生物治疗的新靶点提供理论和实验依据。 方法 (1)沉默及过表达病毒的构建:构建3个针对DEK基因的shRNA载体,使用LipofectamineTM2000转染shRNA载体到HCT116细胞内,利用WesternBlot方法检测下调DEK蛋白水平的效果,挑选沉默效率最高的干扰片段载体,进行慢病毒包装。Anti-diabetic Compound Library,构建DEK过表达载体并进行慢病毒包装。 (2)稳定感染细胞株的获得:用DEK沉默病毒、过表达病毒及相应对照感染HCT116细胞,筛选稳定沉默DEK基因、稳定过表达DEK基因的细胞及相应对照细胞。 (3)细胞增殖相关生物学特性的改变:通过MTT法绘制细胞增殖曲线、软琼脂克隆形成实验、流式细胞仪等分别检测DEK沉默、过表达的HCT116细胞及相应对照细胞的增殖速度、克隆形成能力及细胞周期。 结果 (1)三个干扰载体pLKO.1-DEKRNAiA,pLKO.1-DEKRNAiB和pLKO.1-DEKRNAiC转染HCT116细胞后,与转染pLKO.1-TRCcontrol的对照细胞相比,DEK蛋白总量均有下降。下调最显著的为pLKO.1-DEKRNAiA。相较于对照,使用pLKO.1-DEKRNAiA包装的慢病毒感染HCT116细胞后,能够稳定沉默DEK的表达。 (2)WesternBlot结果显示,过表达载体pLVX-AcGFP1-N1-DEK包装的慢病毒感染HCT116细胞后,细胞DEK蛋白表达水平相较于相应对照细胞显著上调。 (3)MTT法绘制细胞增殖曲线发现,DEK沉默的HCT116细胞增殖速度相较于其对照组明显下降;过表达DEK的HCT116细胞增殖速度显著上升。 (4)软琼脂克隆形成实验显示,DEK沉默的HCT116细胞克隆形成明显减少;过表达DEK的HCT116细胞克隆形成数量显著多于相应对照细胞。 (5)流式细胞仪检测细胞周期结果表明,HCT116-DEKRNAi细胞G0/G1期百分率增加到74.9%,S期减少到15.2%,与相应对照HCT116-RNAiCON细胞G0/G1期63.3%、S期22.2%相比,差异有显著性(P

多倍体肿瘤的发生与耐药的相关性研究

目的: 恶性肿瘤严重威胁人类健康,化疗作为恶性肿瘤综合治疗中必不可少的方法,Tie-2 抑制剂,在临床治疗中发挥着重要作用。纺锤丝毒性药物(如紫杉醇、多西他赛等)是妇科肿瘤治疗中常用的一线化疗药物。在临床工作中我们观察到:在化疗初始阶段,肿瘤一般对所用药物敏感,但在随后的不同阶段多数肿瘤会出现耐药、复发,还有部分肿瘤甚至在初始治疗的过程中就出现耐药。 肿瘤耐药的机制是复杂多样的,关于纺锤丝毒性药物的耐药机制的研究目前多集中在多药耐药基因与肿瘤耐药的关系方面。Topoisomerase 抑制剂,课题组前期研究发现:在体外培养中,有些肿瘤细胞在接受纺锤丝毒性药物治疗过程中除部分以凋亡告终外,还有部分肿瘤细胞并不表现为凋亡现象,而是以形成多倍体(四倍体甚至八倍体)细胞为特征;这些多倍体肿瘤细胞不仅没有被化疗药物所杀灭,反而在短暂调整后继续进行DNA的复制,他们不但可以长期存在,同时表现出了对多种不同作用机制的药物更强的耐药性,我们推测,这些化疗筛选后的“幸存者”是肿瘤耐药、复发的根源之一。国外的一些研究也报道了相似的结果:多倍体肿瘤细胞具有高度的遗传不稳定性,对放化疗均极不敏感,具有多倍体亚克隆的肿瘤预后更差。因此我们提出“纺锤丝毒性药物诱导形成的多倍体肿瘤是耐药的重要表现或又一重要机制”这一假说。 课题的前期研究初步探讨了多倍体肿瘤细胞发生凋亡逃逸及耐药的可能机制,发现:在纺锤丝毒性药物诱导产生多倍体肿瘤细胞过程中,凋亡通路的异常,特别是抗凋亡基因Bcl-2的异常表达起着重要的作用;在多倍体耐药中,同样发现Bcl-2的异常表达起着重要的调控作用。Transferase inhibitor,作为纺锤丝毒性药物发挥细胞杀伤作用的主要途径,凋亡通路上各调控点的正常运作起着至关重要的作用。有实验表明,Bcl-2作为凋亡的各种信号转导途径的共同通路或交汇点,可增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性,抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞凋亡。这与我们的实验结果一致,因此提示:抗凋亡基因Bcl-2的高表达在多倍体肿瘤形成及耐药过程中的调控作用,很可能成为后续研究对抗多倍体耐药的重要切入点。 那么临床中,经紫杉醇等纺锤丝毒性药物治疗后耐药、复发的肿瘤是否也出现上述变化——形成多倍体?本研究拟通过临床肿瘤组织实验,进一步探讨经纺锤丝毒性药物治疗后肿瘤DNA倍体的变化(多倍体肿瘤的形成)与耐药发生的关系,及抗凋亡基因Bcl-2的表达在多倍体肿瘤的形成及耐药发生中的意义。 方法: 收集15例临床经纺锤丝毒性药物治疗前后的同一患者的肿瘤组织病理(包括复发耐药及正在进行新辅助化疗的两类患者),应用荧光原位杂交技术检测经纺锤丝毒性药物治疗前、后DNA倍体的改变情况,同时,应用免疫组织化学法检测化疗前、后组织中抗凋亡基因Bcl-2的表达情况。

miR221/222对肺癌细胞株XWLC-05中PUMA的调控研究

目的利用荧光素酶报告基因实验对miR221/222的靶基因(PUMA)进行验证;通过MTT及caspase检测,研究miR221/222对肺癌细胞XWLC-05增殖及凋亡的影响;应用实时荧光定量PCR技术检测PUMAmRNA在肺癌细胞中的表达差异,S6 Kinase 抑制剂,探讨miR221/222在云南宣威肺癌细胞株XWLC-05中对其靶基因PUMA的调控作用。 方法1.通过基因克隆的方法构建荧光素酶报告基因载体; 2.培养云南宣威肺癌细胞株XWLC-05,通过细胞转染进行后续实验; 3.进行荧光素酶报告基因实验,检测荧光素酶活性,Sirtuin 抑制剂,验证PUMA是否为miR221/22的靶基因: 4.应用MTT实验研究miR221/222对细胞增殖的影响; 5.通过caspase3/7、9的活性检测,分析细胞凋亡状态; 6.应用实时荧光定量PCR技术检测PUMAmRNA的表达差异。 结果 1.所构建的荧光素酶基因载体经测序结果显示正确; 2.荧光素酶报告基因分析显示:rniR221/222能够直接作用于PUMA基因的3′UTR端。 3.MTT检测细胞增殖状态:Over-expression转染的组别能促进细胞增殖;In-expression转染的组别能有效抑制细胞增殖。 4.caspase3/7、9活性的变化为:Over-expression转染的组别caspase3/7、9活性均降低;STAT 抑制剂,In-expression转染的组别caspase3/7、9活性均升高。 5.实时荧光定量PCR检测PUMAmRNA的表达变化,结果显示:XWLC-05细胞经转染后各个处理组之间PUMAmRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 1.成功构建了荧光素酶报告基因载体; 2.在云南宣威肺癌细胞株XWLC-05中,PUMA是miR221/222的靶基因; 3.miR221/222能够通过PUMA影响细胞增殖及凋亡; 4.miR221/222在与其靶基因PUMA的作用过程中,从mRNA的水平来看,对于降解mRNA无明显作用。

Hsa-miR-34a在人乳腺癌中的表达及其对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的: 检测Hsa-miR-34a在人乳腺癌组织与癌旁组织及在乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞中的表达差异,研究其对乳腺癌细胞系增殖、迁移和侵袭的影响,并预测miR-34a可能的靶基因,为阐明miR-34a在乳腺癌发生发展中的作用及调控机制提供理论依据。 方法: 1.通过实时荧光定量PCR方法检测miR-34a在20例人乳腺癌组织与对应的癌旁正常组织(距离癌组织边缘>5cm)以及其在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7与正常乳腺上皮细胞MCF-10A中表达量的差异。 2.体外利用脂质体转染技术将miR-34amimic转染至乳腺癌细胞,MTT法检测细胞增殖能力,RAAS inhibitor,Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。 3.运用靶基因预测软件(TargetScan、PicTar、miRanda)共同预测并分析miR-34a可能的靶基因。 结果: 1.miR-34a在人乳腺癌组织中的表达量低于癌旁正常乳腺组织(P

颈外动脉BMSC移植对脑外伤大鼠神经功能和学习记忆的影响

目的:探讨BMSC通过颈外动脉移植后对脑外伤大鼠神经功能和学习记忆的影响,PARP 抑制剂,为临床应用BMSC治疗TBI提供理论依据及新方法。 方法:选用健康清洁级Sprague-dawley(SD)大鼠10只,进行水迷宫测试后随机分为TBI组和BMSC移植组。采用Freedom自由落体器制作大鼠皮质运动区脑挫伤模型,将培养纯化并鉴定的BMSC于术后当天经颈外动脉移植入体内;术后1d、3d、7d、15d行改良神经功能缺失(NSS)评分,并于术后15天进行水迷宫测试以观察动物学习记忆能力。15天时取脑组织用免疫荧光技术在荧光显微镜下检测hochest标记的移植BMSC在体内存活、迁移情况。 结果:1.骨髓间充质干细胞体外培养及签定本实验最初分离的细胞呈悬浮状态,6h后即有细胞贴壁。为去除成纤维细胞,采用差速贴壁法于10h将全量换出液体,移入另一24孔板。24h后贴壁细胞增多,胞体逐步呈扁平的梭形、多角形。4d左右,原代细胞均匀于瓶底生长,细胞形态为长梭形,多角形,有不规则突起。传至3-4代可用于移植。免疫组化染色显示,BMSC呈CD44阳性染色呈棕黄色。 2.成功建立脑外伤大鼠动物模型 大鼠给予Freedom自由落体器撞击伤后,PDGFR 抑制剂,大部分模型颅窗出血严重,行止血后,挫伤部位脑组织肿胀,膨出开颅窗口。行为学观察显示,单纯手术组和干细胞移植组,大部分大鼠发生抽搐,瘫痪不能正常行走。NSS评分发现,TBI大鼠四肢与躯干失去平衡功能,容易跌落。第1天和第3天单纯手术组和细胞移植组各组大鼠NSS评分无明显差异。而BMSC移植组的NSS评分至第7天后(6.5±1.19)与单纯手术组(TBI)(8.75±0.68)比较显著减少(P