Monthly Archive: October 2016

人泪腺腺样囊性癌细胞的培养、观察及其肿瘤干细胞样细胞的分离培养

目的 1.为了获得人泪腺腺样囊性癌细胞,为建立人泪腺腺样囊性癌细胞系奠定前期基础。 2.初步了解人泪腺腺样囊性癌细胞的形态学特征,包括细胞形态、生长特点、细胞标志物和电镜结构,为深入了解该细胞提供理论依据。 3.证实人泪腺腺样囊性癌细胞中存在肿瘤干细胞样细胞,并进行初步分离培养和血清诱导分化,为深入研究人泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞提供理论支持。 方法 1.实验第一部分:取天津医科大学眼科医院(原天津医科大学眼科中心)2011年5月一例原发泪腺腺样囊性癌患者的新鲜肿瘤组织,采用组织块培养法,获得原代细胞。运用连续传代、机械刮除、反复贴壁和消化排除等方法去除杂细胞。利用相差显微镜、透射电镜、扫描电镜等观察细胞形态。采取细胞免疫化学法检测细胞波形蛋白(vimentin)、广谱细胞角蛋白(cytokeratin,pan)、S-100蛋白、结蛋白(desmin)、CD34等蛋白的表达情况。采用免疫组织化学法检测肿瘤组织vimentin)、cytokeratin(pan)、S-100蛋白、desmin等蛋白的表达情况。消化法绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间。 2.实验第二部分:采用无血清培养法从人泪腺腺样囊性癌细胞中分离培养肿瘤干细胞样细胞,并对其进行血清诱导分化,证明其具有自我更新、不断增殖及可逆分化能力。 结果 1.国内外首次成功获得可稳定传代的人泪腺腺样囊性癌细胞(lacrimaladenoidcysticcarcinoma,LACC):PKC 抑制剂,组织块原代培养第5天见周围开始有细胞爬出,此后细胞缓慢增殖,第32天进行首次传代,第69天发现典型的上皮样细胞克隆。运用多种方法去除杂细胞,至第8代细胞基本纯化。纯化后细胞己稳定传至100代以上。 2.LACC细胞具有以下形态学特征:1)相差显微镜下观察:细胞贴壁生长,核类圆形,核浆比高,核仁数个:核分裂相多见,可见瘤巨细胞;细胞排列不紧密时,细胞可呈长椭圆形、三角形、梭形、多角形等多种形态;细胞排列紧密时,呈多边形的上皮样细胞形态,PLK 抑制剂,表现为典型的“铺路石”样生长;密度继续增高时,细胞接触抑制消失。2)透射电镜和扫描电镜下观察:细胞呈现低分化恶性肿瘤细胞的典型特点,核浆比倒置,胞浆少,胞核大,异型性明显;核仁1至数个,核内染色质丰富,常染色质多见,异染色质边集;不同细胞内细胞器发育差别大;细胞间信号沟通丰富,丝状伪足多级分支。3)细胞免疫化学法观察细胞标志物的表达:vimentin、cytokeratin(pan)和S-100蛋白呈阳性,desmin、CD34蛋白呈阴性,与源肿瘤组织染色结果一致。4)细胞生长动力学分析:细胞生长曲线类似“S”形,细胞倍增时间37.1h。 3.利用无血清培养基从人泪腺腺样囊性癌细胞中成功获得呈类球形或葡萄串样细胞团生长的人LACC肿瘤干细胞样细胞。LACC细胞接种到无血清培养基24h后,即可观察到细胞团悬浮生长或半贴壁生长,细胞团内细胞形态均一,生长状态良好,随时间和传代增加,Proteasome 抑制剂,细胞团逐渐增大。 4.人LACC肿瘤干细胞样细胞团经血清诱导后可贴壁生长,贴壁细胞形态特点与LACC细胞相似。 结论 1.国内外首次获得纯化的人泪腺腺样囊性癌细胞,为建立稳定、永久的人泪腺腺样囊性癌细胞系奠定了前期基础,为深入研究人泪腺腺样囊性癌的生物学行为机制提供了重要的种子细胞。 2.证实了人泪腺腺样囊性癌细胞中存在肿瘤干细胞样细胞,具有自我更新、不断增殖及可逆分化等肿瘤干细胞特性,为人泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞的后续研究开辟了前期道路。

奶山羊雄性生殖干细胞(mGSCs)减数分裂相关信号途径的探索

雄性生殖干细胞(mGSCs),也称作精原干细胞(SSCs),是近年来发育生物学最具有吸引力的研究热点之一,雄性生殖干细胞的研究在生物医学、畜牧生产等领域都具有广泛的应用前景。奶山羊雄性生殖干细胞主要定位于睾丸曲细精管基底膜,是奶山羊睾丸内精子发生的基础,精子生成于睾丸的曲细精管内。雄性生殖干细胞的减数分裂受许多基因的精确时序调控。目前,IKK inhibitor,已发现了一些基因会促进小鼠生殖细胞减数分裂的起始,但是关于奶山羊雄性生殖干细胞减数分裂的研究还较少,相关机理还很不清楚。 本研究检测了不同时期奶山羊睾丸组织中Boule、Stra8、P53和miR-34c的表达情况,对分离纯化得到的奶山羊mGSCs进行生殖细胞及多能性细胞标志基因和蛋白表达的检测。随后通过在奶山羊mGSCs上过表达相关基因,并对减数分裂其它相关基因进行检测来确定它们之间是否存在调控关系。我们在奶山羊mGSCs上发现的相关信号途径有:(1)Boule可以直接调控Stra8的表达并促进其转录和翻译,进而可能促进减数分裂的进行;(2)过表达P53可以激活miR-34c的表达,miR-34c表达是P53依赖性的;(3)过表达Boule和Stra8可以上调miR-34c的表达,但不是通过P53引起的。 1.Boule促进mGSCs的减数分裂 Boule是减数分裂过程中一个相对保守的基因,它编码的RNA结合蛋白是精母细胞进行减数分裂所必需的。Integrase 抑制剂,BOULE蛋白的缺失会阻滞精子发生过程中减数分裂的启动进而造成不育。至今为止,Boule在奶山羊睾丸组织中的表达规律和功能均不清楚。实验证实Boule在成年奶山羊睾丸组织中表达量明显高于青春期、胎羊以及间性羊和无精羊。在mGSCs上过表达Boule48h后,减数分裂相关基因的表达也明显上调,Stra8上调最为明显,通过Western-blot和荧光素酶报告基因载体技术,进一步证实Boule可以直接作用于Stra8并上调其表达。同时我们在奶山羊mGSCs上过表达Boule的下游基因Cdc25A,并未检测到Stra8表达水平有明显改变,而RA可以诱导Boule和Stra8的表达。结果证实Boule在奶山羊精子发生过程中发挥着重要的功能,过表达Boule可以促进奶山羊的减数分裂和精子发生。 2.miR-34c受P53调控并促进mGSCs的凋亡 MicroRNA(miRNA)是一类对基因进行转录后调控的非编码小RNA。已有的证据表明miRNAs在一系列生物学过程发挥重要功能,然而miR-34c在雄性生殖干细胞的研究比较少。我们将miR-34c模拟物和抑制剂转染mGSCs,通过形态学观察、Brdu染色、流式细胞术、Q-RT-PCR和Western-blot等检测发现miR-34c可以促进mGSCs的凋亡,降低其增殖能力,并阻滞细胞周期。Mdm2 inhibitor,在mGSCs中过表达P53也可以发现miR-34c的表达有明显上调。因此,我们得出结论:miR-34c可以促进mGSCs的凋亡并降低其增殖能力,并且miR-34c是依赖P53调控的。 3.mGSCs中过表达Boule和Stra8不通过P53上调miR-34c的表达 生殖是所有动物赖以生存的基础,精子发生是完成繁殖所必须经历的过程,精子发生是一个复杂的发育过程其最终目的是源源不断的产生单倍体精子。当前研究已表明:Boule和Stra8在雄性生殖细胞的减数分裂起始过程中发挥重要作用,而miR-34c是精子发生过程后期完成所必不可少的miRNA,但是其主要功能是促进多种细胞凋亡。我们发现过表达Boule和Stra8可以上调miR-34c的表达,在我们先前研究已证实miR-34c是P53依赖性的,所以我们进一步探索Boule和Stra8造成的miR-34c的上调是不是通过P53引起的,发现过表达Boule和Stra8后,细胞的增殖能力变化不大,同时P53在mRNA和蛋白水平的表达也无明显改变,所以Boule和Stra8上调miR-34c可能是促进mGSCs减数分裂造成的。