Monthly Archive: November 2016

乳腺癌细胞中miR-200c的检测 正常乳腺上皮细胞株MCF-10A,基底型乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT549和管腔型乳

乳腺癌细胞中miR-200c的检测 正常乳腺上皮细胞株MCF-10A,基底型乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT549和管腔型乳腺癌细胞株MCF-7、BT474细胞,依据Trizol Reagent试剂的说明书进行操作,提取细胞总RNA;按照PrimeScript RT reagent Palbociclib体内 kit说明书进行逆转录反应,获得cDNA;以cDNA为模板,采用茎环法依据SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应以检测这5株细胞中miR-200c的表达水平。 2. miR-200c mimic,inhibitor及siRNA和plasmid的转染 采用阳离子脂质体法进行转染,按照lipofectamine2000操作说明进行操作,采用无血清培养基培养细胞,当细胞融合度达到70%左右时,将mimic,inhibitor,siRNA或plasmid稀释于转染专用培养基Opti-MEMI Reduced Serum Medium中,lipofectamine2000同样用Opti-MEMI Reduced Serum Medium稀释后,与mimic, inhibitor, siRNA或plasmid溶液混合,室温下静置20min后,加入培养板中。继续在培养箱中孵育4-6h后,将培养基换成含有血清的完全培养基,转染完成,48h后提取细胞的RNA或蛋白或进行后续的处理。为有效抑制niR-200c的功能簇,miR-200c inhibitor需与miR-429inhibitor同时转染。 3.细胞辐射及克隆形成实验 细胞经消化制成单细胞悬液后,按照预定数量接种于6孔板中,设0,2,4,6,8五个剂量组,每个剂量组三个复孔。照射后将细胞置于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱内继续培养12-14天,期间根据培养液pH值变化适时更换新鲜培养液。当培养板孔中出现肉眼可见克隆时,终止培养,弃去培养液,PBS清洗细胞2遍,甲醇固定,1%结晶紫乙醇溶液染色,显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数,计算克隆形成率和存活分数,并运用GraphPad Prism5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合,并计算辐射增敏因子SER10。 4. Western blot实验 处理后的细胞提取总蛋白,按照BCA法测定蛋白浓度,加入5×SDS-PAGE loading Buffer进行蛋白变性,然后经电泳、转膜、封闭后,孵育一抗和二抗,最后采用ECL法在显影仪上进行显影。 5.构建稳定表达GFP-LC3的MDA-MB-231细胞 将5×105/孔的细胞接种于6孔板中,培养12h待细胞密度达40%左右,加入MAP1LC3B和对照LV5-NC慢病毒悬液100μl/孔(MOI=20),并设2孔加入终浓度为6ug/ml的polybrene以增加感染效率,24h后更换培养基,72h后在荧光显微镜下拍照并计算感染效率。随后采用流式细胞仪分选GFP+细胞,以获得比例较高的GFP+细胞扩大培养,得到稳定表达GFP-LC3的细胞。 PLX-4720半抑制浓度 6.生物信息学分析预测miR-200c调节自噬的靶基因 利用三大常用miRNA数据库TargetScan,Pictar和miRBase对miR-200c可能的靶基因进行预测分析,将这三个数据库预测到的结果取交集以提高可信度,然后在基因功能分析网站上查询这些基因的功能,并且在Pubmed里进行检索查询这些靶基因的功能是否与自噬相关。 7.检测乳腺癌细胞中miR-200c过表达后UBQLN1的表达 在乳腺癌细胞中通过转染miR-200c…
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Expression of cytokine-induced neutrophilchemoattractant-1 was de

Expression of cytokine-induced neutrophilchemoattractant-1 was determined by enzyme immunoassay.RESULTS:Conventional subcultivation yielded activelygrowing cells.One clone was obtained after limiting dilution,and designated as SIPS.This cell line has been passagedrepeatedly more than 2 years,and is thus likely immortalized.SIPS cells retained morphological characteristics of…
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6%,而敏感性也较高,为81 3%;以交叉验证的方法进行可靠性分析,获取ROC的曲线下面积,PIN方法具有最大的ROC曲线下面积,

6%,而敏感性也较高,为81.3%;以交叉验证的方法进行可靠性分析,获取ROC的曲线下面积,PIN方法具有最大的ROC曲线下面积,即相比较具有最高的可靠性。 随后,我们从GEO数据库中筛选出鸡感染禽流感的四组数据。分别为GSE32378,鸡感染H5N1;GSE31476,鸡感染H1N1;GSE31505,鸡感染H9N2;GSE31506,鸡感染H5N2。选取PIN方法进行差异通路和差异表达基因的预测,并对这些差异表达基因进行染色体定位、GO注释富集分析,映射到蛋白质相互作用网络进行分析。可知筛选四个数据集得到的差异基因,在染色体定位分布上有较小差异;在GO注释富集分析中差异较小;蛋白质相互作用网络的拓扑分析结果显示,四组数据中获得的hub蛋白不同,其对应得到的重要基因也不同;在通路相互作用网络分析中,不同的流感感染过程重要的基因也不同。鸡感染H1N1和H5N2过程中有共同的重要基因CBL和GOT1;鸡感染H9N2和H5N2过程中有共同的重要基因ATP2A2。由我们的统计结果显示,在鸡感染这四种禽流感病毒的过程中,核糖体、氧化磷酸化、嘌呤代谢、Wnt信号通路、TGF-β信号通路及Jak-STAT信号通路都起到了重要的作用。 最后,我们还从GEO数据库中选择人、猪、鸡感染H1N1三组数据,分别为GSE31524,人感染H1N1;GSE35738,猪感染H1N1;GSE31476,鸡感染H1N1。采用上面4组数据同样方法分析处理,可知筛选获得的差异基因在生物过程、分子功能及细胞组成的GO注释富集分析中差异较大;蛋白质相互作用网络的拓扑分析其hub蛋白不同,其对应得到的重要基因也不同;针对通路相互作用网络分析,不同的物种感染H1N1流感过程连接多条通路的重要基因也不同,但MAPK信号通路和Jak-STAT信号通路在H1N1的感染中起着重要的作用。5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,简称5-HMF),分子式为C6H6O3,纯品有甘菊花味,为暗黄色液体、粉末或针状结晶,易液化,是一种呋喃类化合物,主要来源于糖的受热分解和美拉德反应,广泛存在于含糖量高的植物、热加工食品和中药中。近年来研究表明,在少量摄入量情况下,5-HMF对人体不存在严重的健康风险,且它的生物活性逐渐被发掘,但对其生理活性的考察还不全面、关于其作用机制研究更是少有报道,因此本文以前人的研究为基础,在细胞分子水平上模拟体内环境,对5-HMF的抗氧化活性和抑制肿瘤细胞增殖活性进行考察,并探讨其作用机理。 为什么 1.本实验采用ABTS法和DPPH法初步研究发现5-HMF具有清除ABTS+自由基和DPPH+自由基的能力;进一步通过建立AAPH诱导红细胞氧化损伤模型,发现5-HMF能够缓解氧化损伤所导致的红细胞溶血,并呈现一定的剂量依赖性,且5-HMF是通过提高抗氧化系统中SOD、CAT和GPx的酶活性、减少有害物质MDA的产生并阻止体内自由基(ROS)的侵袭而从源头上切断脂质等的过氧化反应,进而维持细胞结构和功能的完整性。上述结果表明5-HMF具有抗氧化活性。 还有 查找更多 2.采用MTT法研究5-HMF对5种常见肿瘤细胞和2种正常细胞的抗增殖活性,发现5-HMF对各种细胞增殖的抑制效果依次为:L02

巨噬细胞相对增殖率和细胞因子TNF-α与IL-6的分泌随巨噬细胞培养时间的延长而有增加趋势,但不同干预时间增加趋势略有不同。提示可

巨噬细胞相对增殖率和细胞因子TNF-α与IL-6的分泌随巨噬细胞培养时间的延长而有增加趋势,但不同干预时间增加趋势略有不同。提示可能原因如下:①培养基消耗致营养缺乏导致巨噬细胞RAW264.7大量分泌细胞因子,②炎症细胞因子对巨噬细胞RAW264.7自噬作用。③浒苔多糖的作用。 4.浒苔多糖粗提物促进巨噬细胞RAW264.7mTOR基因表达,与其促进巨噬细胞RAW264.7增殖和促进免疫活化有一致效应,提示P13K/AKT-PTEN-mTOR信号转导通路可能与巨噬细胞RAW264.7免疫调节有关联。喹赛多作为喹嗯啉类药物的新品种,具有良好的抗菌促生长作用,并且具有毒副作用小、安全性高、用药后吸收快、消除迅速、残留期短、无积蓄作用等优点。实验室运用DDRT技术,从喹赛多作用下猪肝组织中筛选出7条差异表达的基因,分别是类胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、ADP核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymeras, PARP)、抗细胞凋亡因子1(The Defender Against Apoptotic Death1, DAD1)、补体C3(Complement Component3, C3)、转酮醇酶(transketolase, TK)和新基因。其中DAD1在阻止细胞凋亡中起作用;而C3补体能通过免疫系统的激活来发挥抗菌抗炎作用,以增加机体免疫力;转酮醇酶在磷酸戊糖途径发挥着关键作用,调节葡萄糖代谢,并以此影响着细胞的增殖等生命活动;EGF、IGF-1属于生长因子类,对于生长具有重要的作用,PARP与DNA的损伤修复有关。因此喹赛多的抗菌促生长作用可能与这7个基因的表达密切相关。由于信号通路是调节基因表达的一种重要方式,喹赛多是通过哪些信号通路来调控这7个基因,在调控这7个基因的信号通路中,主要的信号通路与喹赛多的药物作用有怎样的联系,是本论文所要解决的问题。 寻找更多 1.PK-15细胞中喹赛多调控其作用相关基因表达的信号通路 实验运用RT-qPCR技术,采用相对定量方法,用喹赛多(2lμM)作用于PK-15细胞分别作用0.5h-8h后对7个基因mRNA表达水平的时效关系进行测定。结果表明在PK-15细胞系中,喹赛多(2μM)作用之后,DAD1、TK、PARP、EGF、C3、新基因6个基因的mRNA表达水平在1h显著升高,IGF-1mRNA表达水平在喹赛多作用2h显著升高。运用RT-qPCR、Western Blot等技术,对PK-15细胞中喹赛多调控7个基因表达相关信号通路进行研究。结果表明,PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase)、 NF-KB(Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer)信号通路对IGF-1的表达起主要作用,Erkl/2(extracellular signal-regulated kinasel/2)、JNK(c-Jun BI 2536细胞系 N-terminal kinase)、Jak2(Janus kinase)信号通路对IGF-1的表达可能起辅助作用;对于TK的表达,NF-κB信号通路对其表达起主要作用,Erk1/2、JAK2、PI3K、TGF-β(transforming growth factor)对其表达可能起辅助作用;PI3K、TGF-β、NF-κB信号通路对补体C3的表达起主要作用,Erk1/2起辅助作用;PI3K、NF-κB信号通路对PARP表达起主要作用,TGF-β、Erk1/2对PARP表达起辅助作用;对于DAD1的表达,研究表明,PI3K信号通路对其表达起主要作用,NF-κB、JAK2、TGF-β对其表达可能起辅助作用;PI3K、NF-KB信号通路对EGF表达起主要作用,TGF-β信号通路对EGF表达起辅助作用;PI3K、Erk1/2、NF-κB信号通路对新基因的表达起主要作用。总体来说,在PK-15细胞系中,喹赛多主要通过PI3K和NF-κB信号通路来调控其作用相关7个基因的表达。…
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Since inflammatory cytokines can activate p38 MAPK we hypothesiz

Since inflammatory cytokines can activate p38 MAPK. we hypothesized they might also activate SERT. Using 5HT transport assays, we found that IL-1β and TNF -α stimula…目的研究急性肾损伤时心肌损伤与TNF-a IL-6及caspase-9的表达的变化揭示在急性肾损伤时导致心肌损伤机制。方法35只SD大鼠随机分为5组,正常对照组,肾动脉结扎组,SB203580+肾动脉结扎组,内毒素组,内毒素+SB203580组,每组7只。采用结扎双侧肾动脉建立急性肾损伤模型,分别观测各组血清中和心肌组织匀浆上清液中的TNF-a 点击此处 IL-6和caspase-9的表达情况。结果急性肾损伤组较对照组明显表达增高(P

近年来,尽管恶性肿瘤的检测和治疗手段取得了长足进步,但肿瘤转移仍然是恶性肿瘤治疗失败和患者死亡的最主要原因。系统生物学和功能基因组

近年来,尽管恶性肿瘤的检测和治疗手段取得了长足进步,但肿瘤转移仍然是恶性肿瘤治疗失败和患者死亡的最主要原因。系统生物学和功能基因组学的发展使我们从分子水平对转移本质有了深入认识,在对肿瘤遗传异质性(tumor Protein Tyrosine激酶抑制剂 heterogeneity)、转移前生境(pre-metastatic niche)、上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、失巢凋亡抗性(anoikis resistant)、血管与淋巴管生成(angiogenesis and lymphangiogenesis)等恶性肿瘤转移相关机制形成共识的基础上,提出了加强分子靶向治疗、针对肿瘤干细胞治疗、充分利用小干扰RNA技术等临床抗肿瘤转移的治疗策略。 不能手术和已转移的原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)预后很差,放化疗难以使患者受益。近年来,分子靶向治疗对一些肿瘤已取得突破性进展,肝癌的分子靶向治疗也在临床试验中取得了令人鼓舞的结果。目前的肝癌临床研究主要针对EGFR、VEGF/VEGFR、HGF、MMP、乙肝表面抗原等靶点。本文针对肝癌的分子靶向治疗的研究进展进行了综述。目的探讨自分泌运动因子受体(AMFR)、C-Met蛋白在舌鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组化SABC方法检测80例舌鳞状细胞癌组织切片中AMFR、C-Met的表达。结果与正常舌组织相比,AMFR在舌癌中高表达(76.25%),与TNM分期有相关性(P

结果:经75mg/Lox-LDL处理巨噬细胞不同时间,ox-LDL呈时间依赖性促进清道夫受体AI的表达,而呈时间依赖性抑制小凹蛋白

结果:经75mg/Lox-LDL处理巨噬细胞不同时间,ox-LDL呈时间依赖性促进清道夫受体AI的表达,而呈时间依赖性抑制小凹蛋白的表达.用清道夫受体AI反义寡核苷酸抑制清道夫受体AI的表达,小凹蛋白的表达明显增加.该组细胞内胆固醇含量为(119±7)mg/g,与ox-LDL处理组比较显著减少(P

2)。分别在指定时间点测量每组大鼠PaO2、PaCO2以及肺组织炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)含量、支气管肺泡灌洗液

2)。分别在指定时间点测量每组大鼠PaO2、PaCO2以及肺组织炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)含量、支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞计数、肺血管通透性、肺组织湿/干重比值(W/D)、肺组织HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA含量。另外,分别用海水(1300mOsm/kgH2O)、高渗山梨醇溶液(1300mOsm/kgH2O)、高渗白蛋白溶液(1300mOsm/kgH2O)和双蒸水(0mOsm/kgH2O)处理NR8383细胞,各组溶液保持相同的温度(25℃)和pH值(8.2),观察不同渗透压梯度和时间点下NR8383细胞HIF-1α蛋白和mRNA含量变化,并观察缺氧和高渗联合作用对上述细胞HIF-1α蛋白和mRNA含量变化的影响。此外,应用ATM、PI3K、p38的抑制剂KU55933、LY294002、SB203580及CHX研究高渗调节HIF-1α表达的可能机制。最后,应用HIF-1α的小干扰RNA技术和测量单层细胞通透性的方法研究高渗环境下HIF-1α在炎症反应和肺血管通透性调节中的作用。 有 结果:用高渗液体(海水和高渗山梨醇)气管内滴入组大鼠肺组织缺氧、炎症因子水平、肺血管通透性、肺水肿都明显高于用等渗和低渗液体(等渗海水、等渗山梨醇和淡水)滴入组,同时伴有HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA含量的明显增加。在NR8383细胞上证明了是海水中的高渗因素而不是离子、温度、pH值等其它因素导致的HIF-1α蛋白和mRNA含量的增加;同时,发现高渗和缺氧可以协同作用增加HIF-1α蛋白。此外,实验表明高渗通过增加ATM和PI3K的磷酸化水平上调了HIF-1α mRNA的表达进而使HIF-1α蛋白含量增加,并且通过增加p38的磷酸化水平抑制了HIF-1α蛋白的降解进而使可检测到的HIF-1α蛋白含量增加。最后,我们验证了高渗环境下HIF-1α促进NR8383细胞产生炎症因子,同时HIF-1α通过增加VEGF蛋白表达使RLMVEC单层细胞通透性增加。 结论:海水淹溺导致的肺部高渗和缺氧环境协同增加了肺组织HIF-1α表达,增加了的HIF-1α通过提高肺组织炎症因子水平和肺血管通透性进而加重了肺部炎症反应和肺水肿。研究背景: 海水淹溺是航海、海上作战、作业时常发生的意外伤害事故,吸入海水可导致肺泡-毛细血管膜损伤并伴有通透性增高,富含蛋白的液体聚集于肺泡腔,引起海水淹溺型肺水肿(pulmonary edema induced by seawaterdrowning,PE-SWD),是海水淹溺引起死亡的主要原因之一。PE-SWD的主要病理变化是肺通透性增高,肺水肿形成,引起低氧血症和呼吸困难。如不及时救治和控制病情,易发展为海水型呼吸窘迫综合征(seawaterrespiratory P450 抑制剂 distress syndrome, SW-RDS)。SW-RDS是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的一种。近年来关于PE-SWD/SW-RDS的研究逐渐增多,但是其发病机制仍不完全清楚,缺乏有效的治疗手段,死亡率仍很高。PE-SWD/SW-RDS时,肺泡上皮屏障功能破坏,肺水肿液的清除功能障碍,加之吸入的高渗海水在肺泡内聚集,驱使血管内液体沿渗透压力梯度流向肺泡内,加重缺氧。 缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)在肺泡上皮和毛细血管内皮普遍存在,是细胞间缝隙连接的基本组成单位,不仅发挥细胞间的通讯功能,而且对细胞的生长、分化和凋亡甚至肿瘤形成都有重要作用。有文献报道Cx43与血管通透性有关。近年来研究表明Cx43参与肺损伤的过程,但Cx43在PE-SWD/SW-RDS中的作用及其机制尚不清楚。本实验通过复制大鼠海水淹溺型肺水肿的模型,观察Cx43在海水淹溺型肺水肿中的作用,并进一步研究其可能的作用机制。 实验目的: ⑴观察大鼠海水淹溺型肺水肿模型中Cx43的表达变化。 ⑵探讨Cx43在海水淹溺型肺水肿中的作用及其机制。 实验方法: 实验一 体内实验 24只SD大鼠随机分为4组,正常对照组(0h)、海水淹溺1h组(1h)、4h组(4h)和8h组(8h)。气管内滴注海水的方法复制大鼠海水淹溺型肺水肿的模型,通过肺组织湿干重比值(W/D)、支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量和伊文思蓝漏出指数(ELI)测定肺组织的通透性;RT-PCR和Western Blot等分子生物学实验方法检测肺组织Cx43的含量变化。 体外实验 采用25%体积浓度的海水孵育A549细胞模拟海水淹溺的肺内环境(作用时间为4小时),观察Cx43的表达变化。A549细胞随机分为2组:空白对照组(Control)、海水组(SW),通过RT-PCR和Western 而且 Blot方法检测海水对Cx43的表达的影响。通过对FITC标记的葡聚糖的相对通透性测定单层A549细胞的通透性,观察海水对单层细胞通透性的影响。 实验二 (一)A549细胞随机分为空白对照组(Control)和海水组(SW),WesternBlot方法检测海水对MAPK信号通路的作用。 (二)分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞随机分为5组:空白对照组(Control)、海水组(SW)、ERK1/2抑制剂组(PD)、JNK抑制剂组(SP)、p38抑制剂组(SB),并设阴性对照组。通过FCM分析细胞膜Cx43的表达量。 (三)A549细胞随机分为6组:空白对照组(Control)、海水组(SW)、ERK1/2抑制剂组(PD)、JNK抑制剂组(SP)、p38抑制剂组(SB)和反义寡核苷酸干预组(ASODN)。通过Western Blot方法检测各组细胞Cx43的表达含量。培养单层细胞,通过对FITC标记的葡聚糖的通透性的检测观察单层细胞的通透性,统计分析Cx43含量与单层细胞通透性的关系。 实验结果: 实验一 体内实验…
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7巨噬细胞上使用毒胡萝卜素(Thapsigargin ,Tg)复制内质网应激模型,在此基础上不给予或给予fucoidan处理后,通

7巨噬细胞上使用毒胡萝卜素(Thapsigargin ,Tg)复制内质网应激模型,在此基础上不给予或给予fucoidan处理后,通过Western blot检测LC3(microtubule associated protein light chain 3)的表达从而反映自噬发生水平的变化。同时给予稳定表达GFP-LC3(Green fluorescent protein-LC3)的RAW264.7细胞不同处理后,通过激光共聚焦显微镜直接观察自噬体形成的变化。在明确fucoidan对内质网应激所诱导的自噬是否产生影响后,探讨fucoidan通过激活何种信号途径调控自噬的发生水平。信号通路的检测主要依赖于Western blot技术。本课题重点观察了fucoidan是否对AKT/mTOR/p70S6K信号通路产生影响,接着使用mTOR特异性阻断剂Rapamycin抑制AKT/mTOR/p70S6K信号通路,并用AnnexinV/PI双染流式细胞仪和Western blot方法测定细胞的凋亡情况。最后利用SR-A基因敲除型和野生型小鼠腹腔巨噬细胞,研究了SR-A与AKT/mTOR/p70S6K信号通路改变之间的可能联系。 结果: 用Tg和Tg+Fucoidan分别处理RAW264.7细胞8-12小时后,发现Tg+fucoidan处理组LC3-Ⅱ表达较Tg处理组明显减弱,表明fucoidan和Tg共处理后明显抑制了Tg诱导的巨噬细胞自噬的形成。这种抑制效应在处理后12小时最为明显。同时,给予稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞不同处理后,用激光共聚焦显微镜观察自噬体形成的变化,结果与western 或者 blot检测的LC3-II表达水平相一致,Tg+fucoidan共处理组后抑制了内质网应激诱导的自噬体的形成。 为了阐明fucoidan通过何种通路抑制内质网诱导的自噬的形成,我们又对调控自噬的最关键信号通路mTOR信号通路进行了研究。结果显示Tg+fucoidan处理细胞4小时后,可明显激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,提示fucoidan可能通过激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,抑制内质网应激诱导的自噬形成。 我们接着应用mTOR通路特异性抑制剂Rapamycin干扰AKT/mTOR/p70S6K信号通路,来观察细胞自噬水平的变化。当用Rapamycin预处理RAW264.7细胞30min后再给予Tg+fucoidan处理,发现p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K磷酸化活性均被明显抑制,LC3-Ⅱ的表达明显上调。这些实验结果表明,阻断mTOR通路后,fucoidan抑制内质网应激所诱导的自噬的形成得到了解除,从而进一步证明了fucoidan通过激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,抑制了内质网应激诱导的自噬形成。 随后,我们观察了给予Rapamycin干扰AKT/mTOR/p70S6K信号通路后对于Tg + fucoidan共处理组细胞凋亡率的影响。实验结果显示,Tg + fucoidan+Rap处理组与Tg + fucoidan处理组相比,细胞凋亡率明显降低。这就说明了fucoidan可能是通过激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,抑制了内质网应激诱导的自噬的形成,从而促进了巨噬细胞的大量凋亡。 由于fucoidan是SR-A的配体,因此我们想进一步知道fucoidan激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路是否通过SR-A所介导。于是SR-A基因敲除小鼠模型被用作试验。实验结果显示,Tg 此网站 + fucoidan处理野生型(SR-A+/+)小鼠腹腔巨噬细胞后,与TG组相比,p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K被明显激活。而在SR-A敲除(SRA-/-)小鼠腹腔巨噬细胞中,上述蛋白的表达差异均不明显。因此,fucoidan可能是通过与SRA结合后,激活了AKT/mTOR/p70S6K信号通路。 结论: 作为A类清道夫受体的配体,fucoidan与SR-A结合后,可能通过激活AKT-mTOR-p70S6K通路,抑制了由ER stress所诱导的巨噬细胞自噬的发生,从而促进了巨噬细胞的大量凋亡。目的神经管畸形(neural tube defects;NTD),是最常见的出生缺陷之一。主要表现为无脑儿、脑膨出和脊柱裂等。神经管的发育和分化是一个非常复杂的生物进化过程,并且受各种致畸因素调节和影响,其中最重要的就是环境致畸中的高温因素。在人类,最大的高危因素被认为是孕妇高温。大量的动物实验和对人类的流行病调查证实,孕妇早期接受到物理性的有害因子,如过热的热水浴和高温作业等,都可使孕妇体内产热增加或散热不良而致高热。早期的胚胎极易受到高温环境的损害,高温会阻碍那些分裂中的细胞,使该组织停止发育,特别是胎儿的中枢神经系统极易受到损伤,造成神经管畸形,严重者使胚胎夭折。高温可引起胚胎发育基因的低表达、不表达或超表达,使某些与细胞分化相关的蛋白,特别是酶蛋白和信息传递蛋白异常,从而使细胞分化异常,最终引起神经管发育中信号传导机制障碍,很可能通过改变信号通路上蛋白激酶的表达和功能使胚胎正常的细胞凋亡发生紊乱,从而引起神经管畸形。近年来研究发现,高温刺激能促使丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated Silmitasertib制造商 protein kinases,MAPK)家族中的ERK1/2和JNK1/2发生磷酸化和凋亡基因Caspase-3的活化,证实了细胞凋亡在高温致胚胎先天性神经管畸形中的作用。而JNK/SAPK及p38MAPK为MAPK家族应激激活的蛋白激酶,这2条通路的激活参与多种应激所介导的细胞凋亡,说明p38MAPK有可能也参与高温致神经管畸形的发生。本研究在高温致NTD动物模型上,采用RT-PCR和Western blotting方法检测正常发育中的神经管和高温致畸胚的神经管中p38MAPK以及Bax/Bcl-2, Caspase-3的表达情况,以观察p38MAPK以及Bax/Bcl-2, Caspase-3在神经管正常发育中的作用及其与高温致神经管之间的关系。…
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