Monthly Archive: November 2016

00±0 80)%,大约为Ad-IL-24所诱导凋亡的两倍(Ad-IL-24凋亡率:(5 60±0 27)%,P<0 05)。Ad

00±0.80)%,大约为Ad-IL-24所诱导凋亡的两倍(Ad-IL-24凋亡率:(5.60±0.27)%,P<0.05)。Ad-Rz所诱导得HT-29细胞凋亡率约(1.83±0.18)%,与PBS组和Ad-GFP组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Ad-Rz/IL24可在一定程度上抑制HT-29细胞移植瘤的生长,与PBS比较统计学意义处于临界状态间(P=0.0619,秩和检验),而Ad-Rz、Ad-IL24对移植瘤生长的抑制作用无统计学意义(P>0.05)。使用免疫组化方法在Ad-Rz/IL24及Ad-IL-24处理组移植瘤中均检测到了白细胞介素-24及GADD的表达,Ad-Rz/IL-24可以显著抑制移植瘤组织中VEGF的表达及微血管密度(MVD),各组MVD分别为:PBS 12.8±11.1,Ad-GFP 11.5±1.0,Ad-IL-24 6.0±1.0,Ad-Rz 4.3±0.5,Ad-Rz/IL24 3.5±0.6。(P<0.05)。 结论腺病毒载体介导的双基因anti-VEGF核酶和IL-24(Ad-Rz/IL24)可显著降低结肠癌HT-29细胞中VEGF的表达和抑制HT-29细胞的生长,可显著减少移植瘤组织的血管生成,并可在一定程度上抑制移植瘤的生长。研究背景 什么 前列腺癌是好发于老年男性的恶性肿瘤,欧美多发。在我国,随着人口老龄化趋势加快及PSA血清学检测的普及,其发病呈上升趋势。前列腺癌易发生远处转移,尤其是骨转移,各种治疗效果不理想,患者受癌性疼痛困扰,死亡率较高。因此,阐明前列腺癌骨转移的分子机制,对前列腺癌转移的预防和治疗有重要意义。 趋化因子SDF-1是趋化因子CXC亚家族成员之一,主要在骨髓基质及内皮细胞表达,CXCR4是SDF-1的特异性受体,在神经、血管及造血等组织中组成性表达。SDF-1通过与CXCR4结合,对造血干/祖细胞、肝星状细胞有趋化作用,对诱导造血细胞的归巢及体内再分布有重要意义。近期研究证实SDF-1/CXCR4生物轴与多种肿瘤的播散和转移密切关联。并提出肿瘤细胞基于趋化因子以实现器官特异性转移的理论模型,认为高表达趋化因子受体的肿瘤细胞能向高表达相应趋化因子配体的器官进行选择性转移,但其确切机制仍不清楚。 有 ICAM-1、VCAM-1作为炎性粘附分子主要介导炎细胞-血管黏附作用。ICAM-1配体为淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1),是β2整合素家族中的成员,而VLA-4(CD49d)是整合素β1亚家族重要成员之一,是VCAM-1配体。SDF-1可以通过促使LFA-1在淋巴细胞膜表面重分布,提高LFA-1的黏附能力,促进炎细胞与血管内皮的黏附。而ICAM-1与LFA-1结合,介导免疫细胞向组织迁移、细胞与细胞外基质的粘附等作用。近年来发现ICAM-1、VCAM-1在许多肿瘤的表达明显高于相应正常组织,炎症分子介导的细胞-血管黏附作用与肿瘤的侵袭及转移有明显相似性,提示炎症分子可能以促进炎性进展的方式在在肿瘤侵袭及其转移方面起重要作用。 还有 基于国外研究进展,在本研究中我们用逆转录病毒作为载体,将CXCR4基因转染前列腺癌细胞,增强CXCR4表达水平,在体外通过微孔隔离室将前列腺癌细胞株PC-3与高表达SDF-1α的骨髓内皮细胞BMEC-1共培养,分析前列腺癌细胞对骨髓内皮细胞的迁移效应。将转染CXCR4基因前列腺癌细胞株种植于SCID小鼠前列腺包膜下,观察前列腺癌的骨转移效应,分析SDF-1/ CXCR4信号转导通路在前列腺癌转移及粘附过程中的作用及分子机理,为前列腺癌骨转移机制提供新的实验依据。 方法 1.收集148例手术切除及穿刺确诊前列腺癌存档蜡块。应用免疫组化方法检测前列腺癌组织、前列腺增生组织中CXCR4蛋白的表达,分析其不同表达与年龄、雄激素受体(AR)、病理分级和转移等临床特征的关系。进一步用免疫组化方法CD34标记计数肿瘤间质微血管密度(MVD),观察前列腺癌转移相关分子VEGF及MMP-9与微血管密度的关系。 2.分离健康人外周血单个核细胞,提取总RNA,以其为模板, RT-PCR法扩增CXCR4,获取CXCR4基因全长序列,装入带有绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒质粒pLEGFP-N1,用脂质体法转染PC-3细胞,采用实时定量PCR和Western blotting观察CXCR4表达情况,并通过体外细胞-基质粘附试验和Transwells小室检测肿瘤细胞体外侵袭能力的变化。 3.趋化因子SDF-1诱导培养CXCR4稳定转染PC-3细胞24h后,实时定量RT-PCR和Western blotting方法检测粘附分子LFA-1α/ICAM-1、VLA-4/VCAM-1及mRNA及蛋白表达情况,实时定量PCR和EMSA方法检测HIF-1α及P65NF-κB的mRNA水平及DNA结合活性。探讨前列腺癌细胞SDF-1/CXCR4生物轴功能增强对上述分子表达的影响。 4.接种人前列腺癌PC-3、转染CXCR4的PC-3以及LNcap细胞于雄性SCID小鼠皮下,建立SCID小鼠人前列腺癌移植模型及原位转移模型,观察小鼠活动、移植成瘤率、肿瘤生长及形态学特征,以免疫组化检测CXCR4、前列腺癌特异性抗原PSA以及转移相关因子VEGF和MMP-9的表达情况。并观察CXCR4转染对荷瘤SCID小鼠转移情况及对骨转移灶微环境的影响。 结果 1. 148例前列腺癌组织中CXCR4的表达率显著高于癌旁正常前列腺组织和前列腺增生组织(P

猪SALL4启动子的克隆隆、、、调控元件的筛选和功能验证调控元件的筛选和功能验证从猪肾基因组中克隆长度为2123 bp的SALL4

猪SALL4启动子的克隆隆、、、调控元件的筛选和功能验证调控元件的筛选和功能验证从猪肾基因组中克隆长度为2123 bp的SALL4启动子片段,构建pE2.1和p L2.1报告载体。将报告载体分别转染P19、293T、CHO、Hela和PK15细胞,结果表明猪SALL4启动子在P19、293T、CHO和Hela等细胞中可以被激活,在PK15细胞中不被激活,表明猪SALL4启动子具有组织特异性调控。对2123 bp启动子区域进行生物信息学分析,预测结果显示该序列上有OTX2、OCT4、SOX2、KLF4、ESRRA、ESRRB等转录因子的结合位点。将SALL4启动子与这些转录因子共转,利用双萤光素酶实验检测,结果表明OTX2、OCT4、SOX2、c-Myc、ESRRA、ESRRB、SMAD2、SMAD3等因子对SALL4启动子都有不同程度的上调作用。为了研究SALL4启动子的关键调控区,分别克隆了不同长度缺失的SALL4启动子片段(1901 bp、1071 bp、532 bp和176 bp),将其分别连接到pGL3-Basic上构建报告载体。将这些载体分别转染293T细胞,检测荧光素酶活性,结果确定了猪SALL4启动子在-368 bp至-851 bp区域内存在核心调控区。3.猪SALL4与OTX2相互作用关系的的研究研究通过预测发现猪SALL4启动子上有OTX2的结合位点。在猪iPS细胞中超标达OTX2,然后进行实时定量RT-PCR和WB检测,结果表明SALL4A和SALL4B的表达水平显著降低;相反,敲低内源OTX2的表达,SALL4A和SALL4B的表达都有一定程度的上调,说明OTX2对SALL4有负调控作用。将SALL4不同长度的启动子与pcDNA-OTX2共转,利用双萤光素酶报告系统检测SALL4启动子活性,结果显示OTX2在SALL4启动子-368 WH-4-023订单 bp到-851 bp区域内存在抑制调控位点。为了证明SALL4对OTX2的调控作用,我们克隆了不同长度OTX2启动子片段(O-1865 bp,O-1450 bp,O-1038 bp,O-203 bp),将不同长度的OTX2启动子与pMX-SALL4共转,利用双萤光素酶报告系统检测OTX2启动子活性,结果显示OTX2启动子-1327 bp到-915 bp位置存在SALL4的负调控位点。本实验室前期的研究工作,表明在猪iPS细胞中超表达OTX2,会导致iPS细胞克隆形态变松散,AP染色不均匀,AP阳性克隆数显著降低。我们在OTX2+的iPS细胞中超表达SALL4A或SALL4B,可以使iPS克隆形态好转,提高AP阳性克隆率,证明SALL4对OTX2具有负调控作用。目的:研究高盐对大鼠心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)表型转化影响及其可能的机制。方法:(1)高盐、smad3阻断剂(SISI3)、TGF-β1受体阻断剂(SB431542)浓度及作用时间的确定:采用组织块贴壁法培养大鼠CFs,实验分为对照组(Na+122.27mmol/L),高盐组(Na+149mmol/L、152mmol/L、155mmol/L、158mmol/L、161mmol/L、164mmol/L、167mmol/L、170mmol/L、173mmol/L、176mmol/L),对照+SIS3组(Na+122.27mmol/l+SIS3 点击此处 0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM),高盐+SIS3组(Na+161mmol/L+SIS3 0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM),对照+SB组(Na+122.27mmol/l+SB 这个 1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM),高盐+SB组(Na+161mmol/L+SB 1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM),甘露醇组(与高盐组相应的渗透压),分别培养24h、48h、72h和96h后,经CCK8法检测CFs增殖能力。(2)效应和机制检测:高盐、smad3阻断剂、TGF-β1受体阻断剂浓度及作用时间通过(1)确定,CFs血清饥饿法同步化24h后,分为对照组(Na+122.27mmol/L),高盐组(161mmol/L),对照+SIS3组(Na+122.27mmol/l+SIS3 1μM),高盐+SIS3组(Na+161mmol/L+SIS3 1μM),对照+SB组(Na+122.27mmol/l+SB 10μM),高盐+SB组(Na+161mmol/L+SB 10μM),甘露醇组(与Na+161mmol/L相应的渗透压),干预48h后进行以下实验:免疫荧光和Western Blot检测大鼠CFs中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白额外结构域-A(fibronectin extra domain-A,Fn ED-A)、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、转化生长因子-beta1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、磷酸化smad3(phosphorylate-smad3,p-smad3)蛋白表达;ELISA法检测细胞培养液中TGF-β1分泌情况;Real-Time PCR检测大鼠CFs中α-SMA、Fn ED-A、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、TGF-β1、smad3…
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35%)的抑制活性较好,但对于肺癌A-549细胞株(抑制率=57 63%)的抑制活性略低于阳性对照药的抑制活性(抑制率=68 69

35%)的抑制活性较好,但对于肺癌A-549细胞株(抑制率=57.63%)的抑制活性略低于阳性对照药的抑制活性(抑制率=68.69%)。在12个目标化合物中,对乳腺癌MCF-7细胞株的抑制活性仅有少数超过了阳性对照药,如MWY-a,MWY-g等,而对肺癌A-549细胞株的抑制活性有多数化合物均超过阳性对照药,如MWY-f,MWY-k,MWY-l等,12个化合物对肺癌A-549细胞株的抑制活性较好。目的:通过检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者肿瘤组织及癌旁正常组织中切除修复交叉互补基因1 (excision repair cross comple-menting group1 ERCC1)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor EGFR)和原癌基因Kirsten-Rous肉瘤病毒(K-ras)蛋白的表达情况,研究ERCC1、EGFR与K-ras蛋白表达与NSCLC患者临床生物学特征的关系,以及三者蛋白表达之间的相关性,并探讨ERCC1、EGFR和K-ras蛋白的表达水平对NSCLC患者化疗疗效及生存预后的预测和评估作用。方法:应用MaxVision免疫组织化学染色方法检测于2008年6月至2010年12月期间在承德医学院附属医院胸外科手术的97例(铂二联方案化疗4个疗程的化疗组50例和非化疗组47例)NSCLC患者肿瘤组织及30例对照组(97例NSCLC患者病理蜡块中随机选取30例癌旁正常组织蜡块)癌旁正常组织中ERCC1、EGFR和K-ras蛋白的表达情况,并随访所有患者的术后生存状况。采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理,应用χ2检验及确切概率法分析ERCC1、EGFR与K-ras蛋白表达与NSCLC患者性别、年龄、吸烟指数、分化程度、临床分期、病理类型等临床生物学特征的关系,应用χ2分割进行组间多样本率间的两两比较,校正的检验水准α’=0.0125,并应用Spearman等级相关分析NSCLC患者癌组织中ERCC1、EGFR和K-ras蛋白表达的相关性。应用Kaplan-Meier法分析三者蛋白表达情况与NSCLC患者总生存的关系,组间生存率的单因素比较及患者总生存期的单因素比较采用log-rank检验,Cox比例风险模型用于对NSCLC患者预后多因素的分析。P0.05);EGFR蛋白的表达与NSCLC患者的年龄、吸烟指数、分化程度及临床分期均无明显相关性(P>0.05),而与性别和病理类型明显相关(P0.0125)。女性肺腺癌EGFR阳性表达7例,阴性表达者11例,男性肺腺癌阳性表达4例,阴性表达者7例,男、女性腺癌EGFR阳性表达的差异无统计学意义(P>0.05);K-ras蛋白的表达与NSCLC患者的性别、年龄、分化程度及临床分期均无明显的相关性(P>0.05),而与吸烟指数和病理类型明显相关(P0.0125)。ERCC1与EGFR及ERCC1与K-ras蛋白表达间无相关性,而EGFR与K-ras蛋白在NSCLC患者癌组织中表达呈负相关,相关系数r=-0.371,P0.05),而非化疗组ERCC1蛋白阳性表达患者生存结果更佳(P0.05);非化疗组也得出上述同样的结果。故无论化疗与否,EGFR蛋白阳性表达且K-ras蛋白阴性表达NSCLC患者生存时间高于EGFR蛋白阴性表达且K-ras蛋白阳性表达患者。应用log-rank检验单因素分析患者的总生存,结果显示:TNM分期(P

5umol/l、1umol/l、2umol/l)的PHA665752作用细胞后,于不同时间(24h、48h、72h)收集细胞,使用

5umol/l、1umol/l、2umol/l)的PHA665752作用细胞后,于不同时间(24h、48h、72h)收集细胞,使用MTT法、流式细胞术AnnexinV-FITC/PI法检测各组卵巢癌细胞的增殖及凋亡情况。(3)PT-PCR、Western Blot检测PHA6657522umol/l、HGF40ng/ml作用细胞48小时后XIAP、HGF、c-Met的改变情况。(4)所得数据以错误!未找到引用源。表示,多组间均数比较采用方差分析,p0.05);而40ng/ml、80ng/mlHGF随作用时间延长,细胞存活率增高,各组比较有统计学差异(p0.05);当作用时间延长48h、72h,存活率随浓度的提高而增加,差异有统计学意义(p0.05);而在48h、72h时随着浓度的增加(1umol/l、2umol/l),细胞存活率减少,各组比较有统计学差异(p0.05),而1umol/l、2umol/lPHA665752随着作用时间的延长,细胞存活率下降,各组比较有统计学差异(p0.05),而在48h、72h随着HGF浓度增加(40ng/ml、80ng/ml),细胞凋亡降低,统计学比较有差异(p


目的探讨TGF-β1诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的可能途径和调控机制。方法将小鼠皮肤成纤维细胞(野生型和

..目的探讨TGF-β1诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的可能途径和调控机制。方法将小鼠皮肤成纤维细胞(野生型和Smad 3 Knockout型)分为9组:野生型FB组、野生型FB+TGF-β1组、野生型FB+SB 431542组、野生型FB+SB 431542+TGF-β1组、Smad 3 KO FB组、Smad 3 KO FB+TGF-β1组、野生型FB+SB 203580+TGF-β1组、野生型FB+PD 98059+TGF-β1组和野生型FB+SP600 125+TGF-β1组。各组细胞经同步化处理后,直接以TGF-β1刺激或经上述各激酶抑制剂预处理后再以TGF-β1刺激。收集细胞,…目的探讨TGF-β1/Smad 3信号转导通路对皮肤成纤维细胞的具体调控作用及其机制。方法将原代分离培养并经过鉴定的小鼠皮肤成纤维细胞(野生型和Smad 3 KO型)分为六组:野生型FB组、野生型FB+TGF-β1组、野生型FB+SB 431542组、野生型FB+SB 431542+TGF-β1组、Smad 3 KO FB组和Smad3 KO FB+TGF-β1组。各组细胞经同步化处理后,直接以TGF-β1刺激或经SB 431542预处理后再以TGF-β1刺激。收集细胞抽提总RNA,以实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1、Smad 3、PCNA、MMP 2、MMP 9和TIMP-1的变化情…目的探讨TGF-β1/Smad 3信号转导通路对皮肤创面愈合的影响及其机制。方法实验动物分为三组:Smad 3基因敲除小鼠纯合型组,Smad 3基因野生型小鼠+SB 431542组和Smad 3基因野生型小鼠组。各组动物制成4×4 mm大小的皮肤缺损伤创面,分别观察创面愈合情况,并定期自创缘取材,抽提总RNA后以实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1、Smad3、PCNA、α-SMA、MMP2、MMP9和TIMP-1的表达水平变化。结果 http://www.selleckchem.cn/products/gw9662.html Smad 3基因敲除纯合型小鼠(9天)创面愈合速度明显快于抑制剂组(11天)和野生型小鼠(14天);TGF-β1/Smad 3信号转导通路在创伤后呈现一过性…目的:阐释黄芪总皂苷抑制TGF-β1生成及其信号转导抗肝纤维化的作用机制。方法:44只Wistar雄性大鼠分为假手术组与造模组。其中36只大鼠采用胆管结扎(BDL)制备胆汁淤积性肝纤维化模型,造模第2周起随机分为模型组、黄芪总皂苷干预(AST)组、熊去氧胆酸(UDCA)组,给药3周,观察肝组织胶原染色、羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量以及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平。体外实验以人肝星状细胞株(LX-2)为研究材料,分为正常对照组、转化生长因子(transforming…
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0%和61 4%)明显高于癌旁正常组织;VEGF-C和p38MAPK蛋白在伴有淋巴结转移组的乳腺癌组织中的表达均高于无淋巴结转移组

0%和61.4%)明显高于癌旁正常组织;VEGF-C和p38MAPK蛋白在伴有淋巴结转移组的乳腺癌组织中的表达均高于无淋巴结转移组(P=0.005,P=0.005);在乳腺浸润性导管癌组织中VEGF-C和p38MAPK表达存在显著正相关(r=0.383,P=0.001),并与乳腺浸润性导管癌的TNM分期(P=0.019,P=0.010)有关;VEGF-C和p38MAPK蛋白表达与乳腺浸润性导管癌肿块的大小(P=0.203,P=0.086)和患者的年龄(P=0.0.266,P=0.087)无明显关系。Western 可能 blot也证实,VEGF-C和p38MAPK蛋白在有淋巴结转移组中表达高于无淋巴结转移组。结论 VEGF-C和p38MAPK的蛋白表达与乳腺浸润性导管癌的淋巴结转移密切相关,其有望成为乳腺癌治疗的新靶点。目的:研究雷公藤甲素对正常人肝细胞株L-02细胞凋亡诱导的作用及对细胞内钙离子及p38MAPK磷酸化的影响。方法:体外培养L-02细胞,Fluo-3AM标记与PI法观察雷公藤甲素对细胞的损伤作用,并测定雷公藤甲素作用下L-02细胞内钙离子浓度及Phospho-p38与Total-p38的含量。结果:雷公藤甲素体外诱导L-02细胞损伤,随着孵育时间的延长,细胞内钙离子浓度升高,至9h时达峰值(P

05)。③电镜观察:A组肺组织超微结构无明显异常变化。B组可见到肺泡腔内有水肿渗出液,内含破碎细胞器及红细胞,间质炎性细胞浸润,肺

05)。③电镜观察:A组肺组织超微结构无明显异常变化。B组可见到肺泡腔内有水肿渗出液,内含破碎细胞器及红细胞,间质炎性细胞浸润,肺泡Ⅰ型上皮细胞受损,基膜断裂;以后可见肺泡间隔增厚,内含大量增生、肥大的肺泡Ⅱ型上皮细胞,板层小体空泡化,并且可见胶原纤维向肺泡上皮下和毛细血管基底膜内生长。 4.MMP-2、MMP-9及TIMP-1免疫组织化学检测结果:①MMP-2、MMP-9及TIMP-1在A组正常大鼠肺组织中均有少量表达,三者分布范围基本一致,分布在支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及肺内巨噬细胞。②B组大鼠在染毒1d肺组织中MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达即明显强于A组(P<0.01);主要分布在肺内巨噬细胞、支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞,血管内皮细胞也有表达,后期还可见其它肺间质细胞有表达。MMP-2至35d时表达减弱,与A组比较无统计学意义(P>0.05);MMP-9至21d时表达减弱,与A组比较无统计学意义(P>0.05);而TIMP-1呈持续高水平表达,至35d时表达仍明显高于A组(P<0.01). KU-60019化学结构 5.大鼠肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA的表达:①A组大鼠肺组织中仅有少量MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA的表达。②B组大鼠肺组织中MMP-2 mRNA的表达从1d就明显增强(P<0.01);7d时达高峰;此后开始下降,但直至染毒后28d仍明显强于A组(P<0.05);35d以后与A组相比无统计学差异(P>0.05)。MMP-9 mRNA的表达在染毒1d开始增强(P<0.01);3d即达高峰;7d时仍高于A组(P<0.01);染毒14d及以后与A组相比无统计学意义(P>0.05)。而TIMP-1 mRNA的表达从1d就明显增强(P<0.01);14d达高峰;以后持续维持较高水平,至35d仍明显高于A组(P<0.01)。 结论:1.百草枯中毒引起的肺损伤主要表现为早期的急性肺泡炎和以后逐渐进展的肺间质纤维化。 2.百草枯中毒大鼠体内MDA含量升高、SOD及GSH-Px活力下降,说明PQ可引起肺内炎性反应,进而产生的过氧化损伤及肺内氧化-抗氧化系统失衡是造成急性肺损伤的主要机制。 那个 3.百草枯中毒致急性肺损伤后,肺内MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达不同步造成ECM合成和降解不平衡,从而诱导肺纤维化形成。 第二部分急性百草枯中毒大鼠肺组织中NF-κB、TGF-β_1及p38MAPK的变化研究 目的:观察中毒大鼠肺组织中NF-κB活性、TGF-β_1及磷酸化p38MAPK的变化,探讨其在急性百草枯中毒所致肺损伤中的作用。 方法:选择健康成年SD大鼠48只,随机分为两组:对照组(A组)6只,染毒组(B组)42只。B组于染毒后1d、3d、7d、14d、21d,28d、35d各取6只大鼠,留取肺组织。采用电泳迁移率改变分析法(EMSA)测定NF-κB活性,Western blot法测定磷酸化p38MAPK蛋白表达,RT-PCR法测定MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β_1 mRNA的表达;同时行免疫组织化学观察。A组行同样处理。 结果:1.大鼠肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1、NF-κBp65及TGF-β_1免疫组织化学检测结果:①MMP-2、MMP-9及TIMP-1在A组正常大鼠肺组织中均有少量表达,三者分布范围基本一致,分布在支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及肺内巨噬细胞。B组大鼠在染毒1d肺组织中MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达即明显强于A组(P<0.01);主要分布在肺内巨噬细胞、支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞,血管内皮细胞也有表达,后期还可见其它肺间质细胞有表达。MMP-2至35d时表达减弱,与A组比较无统计学意义(P>0.05);MMP-9至21d时表达减弱,与A组比较无统计学意义(P>0.05);而TIMP-1呈持续高水平表达,至35d时表达仍明显高于A组(P<0.01).②NF-κBp65在A组正常大鼠肺组织中表达较弱,主要分布在支气管上皮细胞,以胞浆为主;在B组大鼠肺组织中表达范围明显扩大,支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺巨噬细胞、血管内皮细胞及其它的肺间质细胞的胞浆及胞核内均有表达。1d至14d其阳性面积百分比明显高于A组(P<0.01);21d及以后NF-κBp65表达减弱,与A组比较无统计学意义(P>0.05)。③TGF-β_1在A组大鼠肺组织中有少量表达,主要分布在支气管上皮细胞及少数血管内皮细胞,偶见肺泡巨噬细胞表达。B组在染毒后1d即明显强于A组(P<0.01)。早期可见细支气管上皮细胞、少数肺泡上皮细胞及血管内皮细胞表达,以后可见大量TGF-β_1强阳性的肺巨噬细胞;还可见其它肺间质细胞表达。至35d时TGF-β_1表达仍较A组高(P<0.01)。 点击此处 2.大鼠肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β_1 mRNA的表达变化:A组:正常大鼠肺组织中即有少量MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β_1 mRNA的表达。B组:大鼠肺组织中MMP-2 mRNA的表达从1d就明显增强(P<0.01);7d达高峰;此后开始缓慢下降,但直至28d仍明显强于对照组(P<0.05);35d以后则与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。MMP-9mRNA的表达1d开始增强(P<0.01);3d时达高峰;7d时仍高于对照组(P<0.01);14d及以后与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。而TIMP-1mRNA的表达从1d就明显增强(P<0.01);14d达高峰;以后维持在高水平,至35d仍明显高于对照组(P<0.01)。TGF-β_1 mRNA的表达从1d就明显增强(P<0.01);14d达高峰;以后维持在较高水平,至35d仍明显高于对照组(P<0.01)。 3.大鼠肺组织NF-κB活性的变化:A组大鼠肺组织NF-κB活性很低。而在B组自染毒1d即较A组显著升高(P<0.01);3d时达到高峰(P<0.01);7d及14d时仍高于A组(P<0.01);21d及以后与A组相比无统计学意义(P>0.05)。 4.大鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的变化:A组大鼠肺组织磷酸化p38MAPK表达较少。B组大鼠肺组织磷酸化p38MAPK自1d开始较A组显著升高(P<0.01);3d时达到高峰(P<0.01);7d及14d时仍高于A组(P<0.05);21d及以后与A组相比无统计学意义(P>0.

1%,脂肪59 8 %,蛋白质20 1%,总热量为501kcal/100g;给予老年两组大鼠每日等热量投喂饲料,喂养八周。于喂养第

1%,脂肪59.8 %,蛋白质20.1%,总热量为501kcal/100g;给予老年两组大鼠每日等热量投喂饲料,喂养八周。于喂养第四周末心脏采血测空腹血糖(FBG),胰岛素(INS),血清甘油三酯(TG),血清总胆固醇(TC),游离脂肪酸(FFA)和骨骼肌甘油三酯(TGm)的含量。喂养四周末,每组均随机选8只行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验判断胰岛素抵抗情况,判断造模成功后高脂组随机分为2组:高脂组和罗格列酮干预(OR)组,每组8只,除继续给予高脂饲料外OR组给予罗格列酮3mg/kg灌胃,高脂组给予等量生理盐水灌胃,继续喂养四周。实验第八周末,行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验评价各组胰岛素抵抗情况,实验前抽取血样用于测定血清各项指标;实验结束后颈动脉放血处死动物,留取股四头肌标本,-70℃保存。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western-blot方法检测骨骼肌PGC-1α、Mfn2以及NRF-1的表达。 结果:1各组一般项目的比较:与青年组相比,老年对照组空腹胰岛素、空腹血糖和游离脂肪酸在喂养第八周均升高;与老年对照组比较,老年高脂组空腹胰岛素、空腹血糖、游离脂肪酸、总胆固醇和甘油三酯明显升高;罗格列酮干预组空腹胰岛素、空腹血糖、游离脂肪酸、总胆固醇和甘油三酯与老年高脂组比较均下降,差异均有统计学意义(p

2±0 6)%和(23 9±0 5)%,套锁纤维舒张百分率高于钩状纤维(t=6 05, P=0 026);(2)促胰液素抗血清可分

2±0.6)%和(23.9±0.5)%,套锁纤维舒张百分率高于钩状纤维(t=6.05, P=0.026);(2)促胰液素抗血清可分别阻断促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为(7.5±0.9)% (t=40.2, P=0.001)和(11.2±1.0)%(t=21.6, P=0.002),两者比较差异有显著性(t=6.39, P=0.024);腺苷酸环化酶激动剂Forskolin分别增强促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为(40.0±2.3)%(t=4.8, P=0.041)和(30.7±1.8)%(t=4.7, P=0.040);cAMP抑制剂分别阻断促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为(17.2±1.8)%(t=5.14, P=0.036)和(14.7±4.3)%(t=4.76, P=0.041);(3)促胰液素使套索纤维与钩状纤维[35S]GTPγS结合率明显升高(52.8±19.5)%(t=3.33, P=0.029)和(44.9±20.9)%(t=3.23, P=0.032),两者比较无明显差异(t=0.83, P=0.455);(4) Gαs抗体可明显抑制促胰液素对套锁纤维和钩状纤维的舒张效应,细胞舒张百分数分别为(9.9±2.33)%(t=7.78, P=0.016)和(8.7±1.9)%(t=4.38, P=0.048);Gαi3和Gαq/11抗体对促胰液素引起套锁纤维舒张效应无明显影响,细胞舒张百分数分别(27.7±4.5)%(t=0.36, P=0.753)和(28.2±2.0)%(t=0.65, P=0.582);对钩状纤维亦无明显影响,细胞舒张百分数分别为(22.6±1.2)%(t=0.718, P=0.547)和(21.5±4.6)%(t=0.758, P=0.528)。表明与促胰液素耦联的G蛋白类型是Gαs蛋白。 结论:促胰液素受体在人LES套锁纤维和钩状纤维均有表达;促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维舒张的规律明显不同,套锁纤维舒张反应强于钩状纤维。部分说明介导促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维舒张的信号转导通路为: 点击此处 什么 Gαs蛋白耦联于腺苷酸环化酶,催化三磷酸腺苷生成环一磷酸腺苷,后者参与平滑肌细胞的舒张。钩端螺旋体(简称钩体)病是由致病性问号钩体(Leptospira interrogans)感染引起的全球性人兽共患病,也是洪涝、地震等自然灾害中重点的防疫和监控的传染病之一。问号钩体可直接经人或动物皮肤或黏膜迅速侵入宿主体内,随着血流播散至各脏器进行繁殖并导致病变,以黄疸、出血、肾衰竭为其典型的临床症状。迄今为止,尚未发现问号钩体能产生外毒素,已报道的一些细胞毒性因子和弱毒性的内毒素样物质难以解释问号钩体感染所致的病理改变,故其致病机制至今不明。 细胞凋亡是一种主动的、高度有序的死亡过程,涉及一系列基因和蛋白质的参与,其中caspase家族蛋白、MAPK家族蛋白等在凋亡的信号传导中扮演着极其重要的角色。业已发现,许多病原微生物能够诱导宿主细胞凋亡,并以此影响疾病的发生发展进程。有研究表明问号钩体可诱导体外培养的单核-巨噬样细胞凋亡,在豚鼠体内可引起肝细胞凋亡,但其诱导凋亡机制尚不明了。由于诱导宿主细胞凋亡不仅可能与问号钩体毒力有关,还可能涉及问号钩体免疫逃避及宿主体内生存,故深入了解问号钩体诱导细胞凋亡机制对于阐明其致病性有重要意义。 研究目的:探讨问号钩体感染对不同类型宿主细胞的影响及其诱导宿主细胞凋亡的信号传导机制,以期为钩端螺旋体病致病机制的阐明提供实验依据。 研究方法:采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法,检测钩端螺旋体对不同细胞的毒性作用;采用流式细胞术(Annexin V/PI双染法)定量检测问号钩体感染对不同细胞凋亡和坏死的诱导作用;透射电子显微镜观察问号钩体诱导J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的形态学变化;采用caspase荧光底物和荧光分光光度计检测问号钩体感染的J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞中caspase的活性变化;western blot法检测问号钩体感染对J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞中PARP、Lamin 无 A/C的裂解及FADD表达的影响;酶联免疫法(ELISA)检测问号钩体感染的J774A.1细胞中JNK和p38MAPK的磷酸化激活情况;应用caspase广谱或特异性抑制剂结合流式细胞术、荧光分光光度计、western blot法,检测这些抑制剂对问号钩体诱导的细胞凋亡和caspase信号传导系统的抑制作用;应用JNK和p38MAPK特异性抑制剂结合流式细胞术、荧光分光光度计、western blot法,检测JNK和p38MAPK在问号钩体诱导J774A.1细胞凋亡中的作用。 结果:(1)问号钩体感染抑制J774A.1、A549和小鼠腹腔巨噬细胞的细胞活性,具有浓度和时间依赖性。问号钩体感染对人脐静脉内皮细胞(EVC304和EVC-EC-C)没有细胞毒性作用。(2)问号钩体诱导J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡,具有浓度和时间依赖性。与J774A.1细胞相比,小鼠腹腔巨噬细胞对问号钩体的凋亡诱导作用更加敏感。问号钩体以时间依赖方式诱导A549细胞发生坏死,而对人脐静脉内皮细胞(EVC304和EVC-EC-C)无细胞凋亡或坏死诱导作用。(3)Caspase家族抑制剂(Z-VAD-fmk)以剂量依赖方式抑制问号钩体诱导的J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡。(4)问号钩体诱导J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞内caspase-3、-6、-8、-9的活化、caspase-3、-6底物PARP、Lamin A/C的裂解及FADD蛋白表达上调,并呈时间依赖性效应。(5)Caspase-8抑制剂可以抑制效应caspase-3、-6的活化及其底物的裂解,并进而抑制细胞凋亡,caspase-9抑制剂则对效应caspase-3、-6的活化、caspase-3、-6底物的裂解及细胞凋亡均无抑制作用,说明caspase-8作为启始caspase介导了问号钩体诱导的J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡,caspase-9可能通过caspase-3的反馈机制而激活,线粒体细胞色素c-caspase-9途径不参与问号钩体诱导的J774A.