Monthly Archive: November 2016

给予GSK3β的特异性阻断剂SB216763(2*10-5M)与RSG(10-6M)共同处理成骨细胞。SB216763能完全逆转R

给予GSK3β的特异性阻断剂SB216763(2*10-5M)与RSG(10-6M)共同处理成骨细胞。SB216763能完全逆转RSG对成骨细胞增殖的抑制效应。提示,RSG抑制成骨细胞的增殖也是通过激活GSK3β实现的。 3.进一步探讨RSG抑制增殖作用的受体机制,联合使用PPARγ特异性阻断剂GW9662(10-6M)与RSG(10-6M),结果GW9662不能阻断RSG抑制成骨细胞增殖的作用。进一步利用siRNA干扰技术,敲低细胞内的PPARγ,RSG抑制增殖的效应仍然存在,提示RSG抑制成骨细胞增殖的作用不依赖于PPARγ。 4.为明确RSG是否通过GPR40来抑制成骨细胞的增殖,我们利用siRNA技术,敲低细胞内GPR40,再用RSG处理细胞,结果发现,RSG抑制成骨细胞增值的作用被完全逆转了。这提示,RSG是通过GPR40发挥抑制成骨细胞增殖的效应。 5.我们也观察了SHP-1在成骨细胞增殖中的作用。利用siRNA技术敲低细胞内的SHP-1,成骨细胞的增殖显著降低。提示SHP-1对成骨细胞的增殖具有正向调节作用。 二、异黄酮类植物雌激素对ERE和CRE转录活性的调节 (一)异黄酮类植物雌激素对ERE转录活性的调节 1、利用脂质体瞬时转染的方法,在MG63细胞上分别过表达ERα和ERβ,给与不同浓度的雌激素和植物雌激素(大豆甙元、染料木素、葛根素、山萘酚、槲皮素)处理,结果发现,在过表达ERα时,E2在10-10~10-8M,都能显著促进ERE报告基因的转录;大豆甙元和染料木素在高浓度(10-6M,10-7M)对ERE报告基因的转录有较强的促进作用;其他植物雌激素,除山萘酚在高浓度时(10-6M)有微弱的促进作用外,对报告基因的转录均没有调节作用。 此网站 过表达ERβ后,除山萘酚和槲皮素的作用与过表达ERα的结果相同外,雌激素和其余的植物雌激素均对报告基因的转录有调节作用。E2从10-9~10-6M,都能显著促进ERE报告基因的转录;大豆甙元以及染料木素对ERE报告基因的转录促进作用均较过表达ERα时的效应显著。而葛根素(10-10~10-6M)对报告基因的转录呈现出非浓度依赖的抑制作用。 2、进一步观察雌激素受体完全拮抗剂ICI182,780以及选择性雌激素受体拮抗剂4-OH-tamoxifen通过不同的ER亚型对ERE报告基因的转录调节作用。将ERα或ERβ与ERE报告基因共转染后,给与ICI182,780或4-OH-tamoxifen处理。ICI182,780仅在过表达ERβ时,对报告基因表现出剂量依赖性的转录抑制效应;4-OH-tamoxifen通过不同的ER亚型,对报告基因的转录调节作用也不同:过表达ERα时,呈现出剂量依赖性的转录促进作用;而过表达ERβ时,则表现出非剂量依赖性的转录抑制效应。 3、将雌激素或植物雌激素与雌激素受体拮抗剂联合使用,观察在过表达不同的雌激素受体亚型后,雌激素或植物雌激素对报告基因的调节作用是否发生改变。结果发现,当过表达ERα时,给与ICI182,780或4-OH-Tam联合作用,雌激素的转录调节作用几乎被完全阻断,大豆甙元和染料木素对报告基因的转录调节作用被部分阻断,而山萘酚的转录调节作用则不受影响。 过表达ERβ时,雌激素,大豆甙元,染料木素以及山萘酚对报告基因的转录调节作用几乎被完全阻断,葛根素对报告基因的转录调节作用则不受影响。由于葛根素表现出拟ERβ拮抗剂样作用,所以当葛根素与雌激素或其他植物雌激素联合使用时,雌激素,大豆甙元,染料木素和山萘酚对报告基因的转录调节作用都能被部分阻断。 (二)异黄酮类植物雌激素对CRE转录活性的调节 1.由于雌激素还具有ERE非依赖的作用机制,我们前期的实验也证明,雌激素对CRE基因具有转录抑制作用。为明确大豆异黄酮是否也具有这样的作用,我们将CRE报告基因转染入MG63细胞中,分别给与不同浓度的雌激素,染料木素和大豆甙元处理。雌激素对CRE报告基因的转录有抑制作用,且具有剂量依赖性。染料木素和大豆甙元都在高浓度时(10-6M),对CRE报告基因具有转录抑制作用。但均不能促进CREB的磷酸化。 Vemurafenib细胞系 外源性给予CRE的激动剂8-Br-cAMP,能促进CRE报告基因的转录活性,而雌激素和染料木素能去除8-Br-cAMP对报告基因的促转录效应,大豆甙元则没有此作用。 2.为进一步确定大豆甙元和染料木素在MG63细胞上,对CRE的转录调节作用是否和雌激素的作用相似,我们观察了他们对MG63细胞上的SGK1和IL-8的mRNA表达的影响。这两个基因的启动子区域都含有CRE-like的序列。结果发现,雌激素,染料木素对SGK1和IL8mRNA的表达都有抑制作用,而大豆甙元仅对IL8的mRNA表达有抑制作用。 进一步用8-Br-cAMP诱导,使SGK1和IL8的mRNA的表达增加,再给予雌激素、染料木素和大豆甙元作用,结果也与未使用8-Br-cAMP诱导时的相一致。以上结果都提示大豆甙元和染料木素都具有雌激素样作用,即可以通过调节启动子中含有CRE like的靶基因的转录活性,发挥调节基因转录的效应。并且染料木素和大豆甙元对于不同的基因,调节转录的机制可能也有所不同。 3.为确定ERs的两类亚型在大豆异黄酮物质的上述转录调节作用中分别起何作用。我们将ERα和β分别与CRE报告基因共转染后,给予雌激素和大豆异黄酮作用,观察药物对报告基因转录活性的影响。 将ERα和CRE报告基因共转染后,雌激素和两种大豆异黄酮物质都能剂量依赖性的抑制CRE报告基因的转录活性。再分别给予雌激素受体拮抗剂ICI182780和选择性雌激素受体调节剂4-OH-tamoxifen,以及ERα特异性受体拮抗剂MPP作用。ICI182780和MPP本身通过ERα都能够促进CRE报告基因的转录活性,4-OH-tamoxifen通过ERα则没有转录调节作用;但是,三种药物分别与雌激素和大豆异黄酮共同作用时,都能够逆转雌激素和大豆异黄酮对CRE报告基因的转录抑制作用。 或者 将ERβ和CRE报告基因共转染后,雌激素对报告基因的转录抑制作用消失了,大豆甙元和染料木素仍然能够抑制CRE报告基因的转录活性,但是缺乏剂量依赖性。使用ICI182780,4-OH-tamoxifen,以及ERβ特异性受体拮抗剂THC作用后,三种药物通过ERβ对CRE报告基因的转录活性都没有影响;但与大豆甙元和染料木素联合使用后,都能够逆转大豆甙元和染料木素通过ERβ对报告基因的转录抑制作用。 结论: 1. RSG显著抑制颅骨来源的成骨细胞的分化,SHP-1对成骨细胞的分化具有促进作用。两者的作用都是通过改变GSK3β的活性实现的。RSG通过激活GSK3β,促进其磷酸化,进而抑制β-catenin的表达;SHP-1则通过抑制GSK3β的活化,来促进分化。RSG抑制成骨细胞中SHP-1的mRNA表达。RSG抑制成骨细胞分化的作用仅部分依赖于PPARγ;同时,GPR40在诱导成骨细胞分化过程中维持低表达,RSG可促进GPR40表达,后者由此介导了部分RSG作用。 2.

3USP2b对TBK1的K63位点泛素化影响 HEK293细胞转染Flag-USP2b或者USP2干扰RNA,以及Myc-TBK1

3USP2b对TBK1的K63位点泛素化影响 HEK293细胞转染Flag-USP2b或者USP2干扰RNA,以及Myc-TBK1、HA-Ub,使用Myc标签抗体做IP, Western blot检测TBK1的泛素化水平。 HEK293细胞转染Flag-USP2b和Myc-TBK1以及HA-Ub (K48)或者HA-Ub (K63),使用Myc标签抗体做IP,Western blot检测TBK1的泛素化水平。 HEK293细胞转染Myc-TBK1, HA-Ub和Flag-USP2b或者USP2bC67A,使用Myc标签抗体做IP, Western blot检测TBK1的泛素化水平。 3.4USP2b对TBK1激酶活性的影响 HEK293细胞转染Flag-USP2b表达质粒或者USP2干扰RNA, SeV刺激6h,使用TBK1抗体做IP,检测TBK1激酶活性。 4. USP2b的抗病毒作用 HEK293细胞转染Contrl质粒、USP2b或者USP2b C67A,24h后进一步转染poly(I:C)或者PBS,8h后,VSV感染24后,收集培养细胞的上清(含VSV),剩余细胞提取RNA,上清做空斑试验,检测病毒滴度;RNA反转录成cDNA, 时间 real-time PCR检测细胞内VSV RNA复制。 HEK293或THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA,方法同上,分别检测病毒滴度以及VSV RNA复制。 5. USP2b在其他天然免疫信号通路中的作用 HEK293细胞转染USP2b质粒或者干扰RNA,同时转染TRIF, cGAS加STING和IFN-β-luc报告基因质粒,报告基因检测IFN-β-luc的活化。 THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA48h,分别用LPS、poly(I:C)刺激或者转染ISD12h, PCR检测IFN-β基因表达。 研究结果: 1.SeV感染HEK293或THP1细胞后,USP2表达下调 2. USP2b负向调控病毒诱导的I型干扰素IFN-β的表达。 2.1过表达USP2b抑制SeV诱导的IFN-β-luc的活性 2.2过表达USP2b抑制SeV诱导的IFN-β基因的表达 2.3过表达USP2b抑制SeV诱导的IRF3-luc的活性 2.4USP2b的点突变C67A不能抑制SeV诱导的IFN-β-luc以及IFN-β基因表达。 3.干扰掉USP2b后,增强IFN-β的表达…
Read more

采用NAC处理ROS水平相对较高的胚胎肝细胞,能显著降低ROS水平,抑制细胞增殖,诱导细胞静息,而p38抑制剂能显著阻断NAC诱导

采用NAC处理ROS水平相对较高的胚胎肝细胞,能显著降低ROS水平,抑制细胞增殖,诱导细胞静息,而p38抑制剂能显著阻断NAC诱导的细胞静息作用。采用H_2O_2处理ROS水平相对较低的成年肝细胞,能显著升高ROS水平,促进细胞增殖,而ERK抑制剂能显著阻断H_2O_2诱导的细胞增殖作用。以上结果说明,调控ROS可以通过选择性激活ERK或p38诱导细胞增殖或静息。 3. GOX可使肝脏ROS水平增高,改变肝脏的静息状态,促进增殖。CAT可以降低ROS水平,阻断GOX的增殖启动作用,说明GOX的促增殖作用与其肝内代谢产物H_2O_2直接相关。ERK特异性抑制剂可以显著阻断GOX的促增殖效应,但效果弱于CAT,说明ERK通路只是ROS启动细胞增殖的调控通路之一。 4. ROS水平在肝再生过程中变化先高后低,与肝切除后再生启动与终止密切相关。肝再生早期,GOX处理可以升高肝脏ROS水平,加重肝切除后氧化应激,抑制肝再生,而CAT处理可以降低肝脏ROS水平,减轻肝切除后氧化应激,但同样抑制肝再生。说明肝再生过程中的ROS水平被精确调控在“所需”范围内,可能是肝再生启动与进展的关键信号因素。 抑制剂 Library 结论: 本课题通过观察正常肝脏发育及肝细胞再生过程中ROS的变化规律,探讨ROS信号改变与肝细胞增殖-静息相互转变的内在联系,从“ROS水平的相对高低是维持肝细胞增殖或静息状态所必需的”这一新视角出发研究肝细胞周期自我调控的实现途径,证明了“ROS信号诱导肝细胞增殖-静息转变”的理论假设,初步阐明了ROS剂量依赖性调控G0期启动、G1期关闭的具体分子机制,为肝再生、发育的调控研究提供新的方向和思路。细菌内毒素可以在局部肠道炎症如炎性肠道疾病(IBD)、坏死性小肠结肠炎(NEC)等和全身性感染诱发的肠道炎症损伤中扮演着十分重要的角色。它可以直接触发免疫和炎症反应,也可以诱导其他的细胞因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素(IL-1,6,8等)和促进炎症反应的介质如环氧化酶-2、前列腺素E2等,这些刺激物也可以加重肠粘膜的损伤,包括肠粘膜的坏死、脱落和肠细胞的大量凋亡,破坏肠粘膜屏障功能,使得肠道细菌(包括阳性细菌、阴性细菌和厌氧菌等)及其裂解的产物如内毒素和外毒素进入血液循环,造成全身性感染或全身性感染继续加重,后者又反过来加重肠粘膜的损伤,形成恶性循环。 由于肠道是机体最大的免疫器官,参与机体的免疫和炎症反应,因此,阻断内毒素的毒害作用,维护肠粘膜完整性具有十分重要的意义。而环氧化酶-2和其催化产物前列腺素等在异常高浓度水平表达时不利于肠粘膜的维护。因此。控制环氧化酶-2的生成具有重要的作用。 盐酸小檗碱是多种草药如黄连素、北美黄连等成分之一,临床上已经用于治疗急性和慢性胃肠炎及腹泻等胃肠道疾病历史悠久,许多实验证实其能有效地抑制内毒素的毒害作用(如内毒素血症肠粘膜水肿坏死脱落、细胞凋亡等)抑制其他促炎细胞因子生成,增加抗炎细胞因子和物质的生成。 http://www.selleckchem.cn/products/AZD6244.html 本课题以内毒素血症大鼠末端回肠标本为研究对象,通过在体实验探讨p38和PPARgamma信号通路变化在COX-2的作用,从而为阐释内毒素血症肠粘膜炎症的病理生理、为临床应用小檗碱治疗肠道炎症奠定理论基础。肥胖是二十一世纪全球共同面临的一个最具挑战性的健康问题。肥胖不仅与心血管疾病,糖尿病,动脉粥样硬化,脂肪肝等慢性代谢疾病密切相关,而且还增加罹患肿瘤的风险。脂肪组织功能失调是肥胖诱发众多慢性代谢疾病的重要因素。新近研究表明,脂肪组织功能的维持主要取决于机体内脂肪细胞形成的能力。脂肪细胞形成包括间充质干细胞的增殖、定向及分化,这一过程不仅受各种脂肪细胞转录因子的级联调控,而且受多种旁分泌、内分泌因子及信号通路的调节。 近年来我们实验室报道了成纤维细胞生长因子(FGF-1),以旁分泌作用方式,通过FGFR1/FRS2/Ras/Erk1/2级联反应,促进人原代前体脂肪细胞(phPAs)和SGBS人前体脂肪细胞株的定向和分化。这一研究成果为进一步在分子水平探索脂肪细胞形成的复杂机理提供了强有力的研究平台。为了寻找FGF下游的脂肪调节因子及肥胖治疗靶点,实验室利用FGF-1处理的phPAs为实验材料,通过基因芯片技术筛选了FGF-1调节的下游靶基因。本文着重探索了其中一个候选基因——BAMBI在人脂肪细胞形成中的作用及其机理。 BAMBI基因发现于1999年,编码产物为一个由260个氨基酸组成的跨膜糖蛋白,由于其胞外结构域与转化生长因子(TGF-β)和骨形成蛋白(BMP)等配体的Ⅰ型受体胞外结构域相似但缺失胞内信号转导结构域,因而也称为伪受体。近年研究发现BAMBI基因参与调控胚胎发育及多种组织器官的肿瘤形成,并参与调控多种与脂肪细胞形成有关的自分泌/旁分泌细胞因子,其中包括TGF超家族成员(TGF-β和BMP)和Wnts。然而BAMBI在脂肪细胞形成中的作用还未见报道。 本文以人原代前体脂肪细胞及SGBS细胞株为实验材料,利用real time PCR技术检测了BAMBI基因在脂肪细胞形成过程中的时序表达情况;用ERK、p38MAPK和PI3K信号通路抑制剂UO126、SB202190和LY294002分别处理SGBS PAs,检测了FGF-1下调BAMBI基因的信号通路。采用siRNA干扰技术及质粒DNA超表达技术转染phPAs和SGBS PAs,利用细胞油红O染色及油红O染色提取法、real time PCR、Western blot、ELISA及细胞葡萄糖吸收检测等技术分析了人为改变BAMBI基因表达对人脂肪细胞定向及分化的影响。同时,在干扰BAMBI基因的前提下,分别利用自分泌/旁分泌细胞因子Wnt3a、TGF-β1及BMP-4处理SGBS PAs,研究了BAMBI基因对这些细胞因子在成脂过程中调节作用的影响。此外,采用了高脂饮食诱导的肥胖小鼠C57/BL6为模型,研究了BAMBI基因在肥胖小鼠脂肪组织中的表达情况。 Trichostatin A 获得的主要研究结果如下: 1.与基因芯片结果一致(FGF-1下调BAMBI基因表达13倍,p=0.01;B-val=50.8),在phPAs及SGBS PAs细胞中,BAMBI基因在FGF-1处理的情况下或脂肪细胞分化过程中极显著地下调;利用抑制剂分析得知,FGF-1下调BAMBI基因的表达依赖于PI3K信号通路。 2. siRNA干扰BAMBI促进了phPAs及SGBS PAs定向及分化的潜能。干扰BAMBI后,前体脂肪细胞分化的比例增加,细胞内脂滴含量增多,脂肪细胞分化标志基因表达水平升高,成熟脂肪细胞分泌抗炎性细胞因子的功能及胰岛素敏感性增强。相反,超表达BAMBI后,抑制了前体脂肪细胞分化。此外,干扰BAMBI对脂肪细胞分化的促进作用与FGF-1的作用一致。 3.干扰BAMBI后细胞内的Wnt/β-catenin信号通路受到抑制,这与FGF-1处理的细胞中Wnt/β-catenin信号通路受到抑制一致。在干扰BAMBI基因的细胞中,Wnt3a抑制脂肪细胞分化的能力受到削弱,而这一过程是通过抑制细胞内Wnt/β-catenin信号通路来完成的。 4.