Monthly Archive: December 2016

B组小鼠症状、组织学检查均符合UC诊断标准,且DAI及组织学评明显高于A组,经过地塞米松和姜黄素干预后,C组、D组、E组和F组DA

B组小鼠症状、组织学检查均符合UC诊断标准,且DAI及组织学评明显高于A组,经过地塞米松和姜黄素干预后,C组、D组、E组和F组DAI及组织学评分有不同程度的降低。2.ELISA结果: B组结肠黏膜中TNF-α、 MPO的含量分别为(382.26±21.82、339.31±13.61)明显高于C组(257.42±19.04、238.95±11.17)、D组(333.67±17.72、298.93±9.94)、E组(287.89±19.57、258.60±13.07)和F组(271.10±13.25、248.52±9.24),有统计学差异(P均<0.01),C组的含量显著低于D组、E组的含量,有统计学差异(P<0.05),C组同F组相比差异无统计学意义(P>0.05);E组、F组较D组含量低,差异有统计学意义(P<0.05),F组较E组降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。3.免疫组织化学法结果:B组小鼠结肠黏膜p-p38MAPK表达(6.80±0.77)明显高于A组(0.52±0.32),差异有统计学意义(P<0.01),经地塞米松及姜黄素低、中、高剂量干预后,C组(2.50±0.82)、D组(4.36±1.02)、E组(3.62±0.79)、F组(3.12±0.63)均较B组有显著降低,有统计学差异(P<0.01),C组表达明显低于D组、E组,差异有统计学意义(P<0.05),D组较E组、F组升高(P值均<0.05),E组与F组差异无统计学意义(P>0.05)。4.RT-PCR结果:B组结肠组织内p38MAPK mRNA明显高于A组,C组、D组、E组和F组均较B组有不同程度的降低,其中以F组表达最低。结论:姜黄素对DSS诱导的小鼠急性期UC有一定治疗作用,可能是通过抑p38MAPK信号通路,减少TNF-α等促炎因子的释放,减轻中性粒细胞的浸润,从而减轻UC小鼠肠粘膜炎症损伤而发挥治疗UC作用。目的:探讨TGF-β1对kruppel样因子15(KLF15)表达的影响及其调控机制 方法:培养大鼠间质成纤维细胞(NRK-49F),给予TGF-β1刺激及KLF15质粒转染NRK-49F过表达观察KLF15和细胞外基质(ECM)变化,通过Real-time Protein Tyrosine激酶抑制剂 PCR检测KLF15mRNA和FNmRNA、CTGFmRNA、COLⅢmRNA变化,并通过WesternBlot检测KLF15和CTGF蛋白表达变化,通过ELSA检测细胞培养上清液FN蛋白和Ⅲ型胶原变化。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)细胞信号转导通路特异性断剂预处理NRK-49F后给予TGF-β1干预,观察FNmRNA、CTGFmRNA、COLⅢ mRNA、KLF15mRNA和KLF15蛋白及相关蛋白的磷酸化水平变化。 结果:TGF-β1干预大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F)后促进细胞外基质的分泌,抑制KLF15的表达。NRK-49F过表达KLF15后细胞外基质表达明显降低,ERK/MAPK和JNK/MAPK通路阻滞剂阻断TGF-β1对KLF15的抑制作用,而给予P38/MAPK通路阻滞剂并未抑制TGF-β1对KLF15的调控作用 结论:KLF15可抑制细胞外基质产生,TGF-β1可能通过ERK/MAPK和JNK/MAPK细胞内信号转导通路调控KLF15的表达,促进细胞外基质的产生。IL-27参与多种炎症反应。干扰素诱导蛋白10(CXCL10)是一种在气道炎症疾病中发挥重要作用的趋化因子。本研究中,我们探讨了在人的原代肺成纤维细胞(HPF)中,IL-27是否调节CXCL10的合成。IL-27或联合其他细胞因子刺激HPF,应用定量PCR和ELISA检测CXCL10的合成,应用放线菌素D检测mRNA的稳定性,应用抑制剂检测相关信号通路,Western Selleck Afatinib 没有 blot加以验证。研究表明,IL-27协同TNF-α在mRNA和蛋白水平上调CXCL10的产生。这种增加CXCL10的产生主要是通过IL-27和TNF-α增强CXCL10mRNA稳定性来实现的,并且p38MAPK途径和PI3K-Akt途径的激活在此协同调节作用中起主要作用,NF-kB途径也部分参与这一过程。有趣的是,IL-27可以促进p38MAPK和Akt途径基础水平的磷酸化,并增强TNF-α介导的上述途径的活化程度。此外,CXCL10mRNA水平稳定性的增强是依赖p38MAPK途径实现的。最终,临床研究显示哮喘、COPD和肺结核患者的支气管灌洗液中可以检测到IL-27,而且IL-27增加的水平与COPD、肺结核患者CXCL10水平增加相关。我们的研究结果表明,IL-27通过协同TNF-α刺激HLF产生CXCL10来增强气道的炎症反应。目的: 研究羟基喜树碱(hydroxycamptothecine,HCPT)对肝星状细胞线粒体凋亡相关蛋白凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)及死亡受体途径相关蛋白FAS、FASL表达的影响,初步探讨HCPT诱导HSC-T6凋亡的作用机制。 方法: 采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液体外培养HSC-T6细胞,待肝星状细胞生长至对数生长期时用无糖DMEM培养使细胞同步化,将细胞分为两大组:①对照组:用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养细胞各1h,6h,12h及24h(分别用B1、B6、B12、B24表示);②HCPT实验组:用浓度为0.5mg/LHCPT进行干预HSC-T6细胞,各培养1h,6h,12h及24h(分别用H1、H6、H12、H24表示),每组实验重复6次。干预时间完成后收集各组的细胞和细胞培养上清液进行以下指标的检测:①吖啶橙/溴化乙锭染色观察HSC-T6细胞的凋亡情况;②逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AIF、Fas、FASL基因水平的表达;③Western blot印记法检测AIF、FAS、FASL蛋白水平的表达;④激光共聚焦显微镜观察AIF在细胞凋亡时胞内定位的变化。 结果: 1、吖啶橙/溴化乙锭双重染色:对照组细胞培养1h、6h、12h、及24h后染色均未见明显改变,细胞凋亡率均较低,各组之间比较无统计学意义(P值均>0.05);0.5mg/L HCPT作用于肝星状细胞株HSC-T61h、6h,未见明显的细胞凋亡情况,细胞凋亡率与各对照组比较无统计学意义(P值均>0.05);作用12h及24h后可见细胞发生形态学改变,如细胞体积缩小、皱缩、细胞核碎裂,较对照组及作用1h、6h后的细胞凋亡率明显升高(P值均0.05),正常组及实验组均未见Fas及FASL表达。 3、Western blot印记法检测AIF、FAS、FASL的表达:各实验组AIF的表达量与正常组比较无统计学意义(P值均>0.

因此,沙眼衣原体诱导产生的炎症因子是导致疾病的关键,沙眼衣原体可直接感染内皮细胞产生各种前炎因子,但其机制目前还不清楚 通过ELI

因此,沙眼衣原体诱导产生的炎症因子是导致疾病的关键,沙眼衣原体可直接感染内皮细胞产生各种前炎因子,但其机制目前还不清楚.通过ELISA和免疫印迹等方法,检测到沙眼衣原体感染HeLa229细胞可产生IL-8,IL-1α,IL-1β,IL-6等前炎因子,并且沙眼衣原体感染可以主要激活宿主细胞MAPK/ERK和MAPK/P38信号通路.抑制MAPK/ERK和MAPK/P38信号通路显示,两条通路在沙眼衣原体感染过程中参与调节不同的炎症因子产生.MAPK/P38信号通路的活化参与调控IL-1α,IL-6的产生,而IL-8则同时受MAPK/ERK和MAPK/P38两条通路的调控.目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)对人脐带静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells,HUVECs)内游离镁离子浓度([Mg2+]i)的调节机制研究。方法我们采用荧光指示剂mag-fura-2,运用PTi阳离子测定系统动态测HUVECs的[Mg2+]i。结果经酪氨酸激酶阻断剂(tyrphostin A23和genistein)、3-磷脂酰肌醇激酶阻断剂(wortmannin和LY294002)、磷脂酶Cγ阻断剂(U73122)预处理,能阻断bF-GF诱导的[Mg2+]i增加。但经磷脂酶Cγ阻断剂无活性的类似物(U73343)和丝裂原活化蛋白激酶阻断剂(SB202190和PD98059)预处理,不能阻断bFGF诱导的[Mg2+]i增加。结论bFGF通过酪氨酸激酶/3-磷脂酰肌醇激酶/磷脂酶Cγ信号传递途径使细胞内的Mg2+库释放Mg2+,从而增加HUVECs的[Mg2+]i。寻常型天疱疮是一种自身免疫性大疱性疾病,以角质形成细胞表面桥粒芯蛋白3成分与自身IgG抗体结合引起棘层细胞松解为特征。但抗体与自身抗原结合后如何进一步导致棘层松解仍然不清。近年来研究表明通过调节p38促分裂原活化蛋白激酶,Rho家族GTP酶,原癌基因c-myc,蛋白酶C和磷脂酶C信号途径可以防治天疱疮自身抗体导致的棘层松解。这些研究表明众多不同的信号分子在维持桥粒稳定中的重要作用。针对这些信号的抑制剂为寻常型天疱疮和其他桥粒相关的大疱性疾病提供了新的治疗思路。在动脉粥样硬化发生、发展的不同阶段,血管平滑肌细胞表型转换具有重要且可能是不同的病理生理学意义。文章复习了近年动脉粥样硬化病损内膜中血管平滑肌细胞来源、血管平滑肌细胞表型转换的分子机制及鉴别不同平滑肌细胞表型的标志性分子,以期为深入理解动脉粥样硬化的发病机制和相关研究提供有益认识。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated 不 JQ1临床试验 protein kinase,MAPK)是广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶,在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用。MAPK有4个主要亚族:ERK、p38MAPK、JNK和ERK5。p38信号通路是MAPK通路的一重要分支,它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。本文就p38MAPK的分型、分布、信号通路的组成及其在法医损伤学领域中的应用现状做一综述,旨在进一步对组织损伤程度和伤后时间推断的法医病理学研究提供参考资料。本文旨在观察p38MAPK与高糖诱导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转变之间的关系。将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为对照组、糖尿病组、胰岛素治疗组,用免疫组织化学、Westernblot检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白表达。采用机械分离和酶消化获取SD大鼠肾小管节段,进行肾小管上皮细胞培养,将肾小管上皮细胞分为对照组、高渗组(20mmol/LD-mannitol)、高糖组(20mmol/LD-glucose)和SB202190(p38MAPK特异性抑制剂)+高糖组,处理72h后收集细胞,用免疫细胞化学检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth Obeticholic Acid价格 muscle actin,α-SMA)、p-p38MAPK和Snail1蛋白表达,Western blot检测p38MAPK、p-p38MAPK、Snail1、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、α-SMA和E-cadherin的表达,RT-PCR检测α-SMA和E-cadherin mRNA的表达。体内和体外结果均显示,高糖状态激活了p38MAPK,这种活化作用在体内可因胰岛素控制血糖而被消除,在体外可被p38MAPK特异性抑制剂SB202190显著抑制;高糖组α-SMA蛋白和mRNA在原代培养肾小管上皮细胞的表达较对照组分别增加12倍和8倍(P

Seven days after injection,Nissl staining was used toobserve the

Seven days after injection,Nissl staining was used toobserve the morphological change in hippocampal CA1 regions.Results:Intracerebroventricular injection of Aβ_(1-40)induced an increase in phosphorylatedMKK3/MKK6 and p38 MAPK expressions in hippocampal tissue.These increases,in combination with enhanced interleukin (IL)-1β protein expression and reducedphospho-MAPKAPK2 and…
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1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,迅速断头处死,在低温修块台上分离出双侧海马组织,置于Eppendorf管中,-80℃保存。 4 大鼠海马C

1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,迅速断头处死,在低温修块台上分离出双侧海马组织,置于Eppendorf管中,-80℃保存。 4.大鼠海马CA1神经元病理形态学观察 HE染色,光镜下观察海马CA1区神经元形态改变。 5.谷氨酸受体免疫组化染色 按照说明书的操作顺序进行SP法免疫组化染色,镜下观察各组海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的阳性神经元数目(面密度Sv值对二者的变化进行定量)。 6. Western-Blot检测海马组织谷氨酸受体蛋白的表达水平 称取海马组织,提取总蛋白,BCA法进行蛋白浓度定量。应用Western-Blot方法检测各组大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的蛋白表达水平。 7.实时荧光定量PCR检测海马组织谷氨酸受体mRNA的表达水平 冰上迅速分离大鼠海马,Trizol提取海马总RNA,逆转录cDNA,采用PrimerScriptTM实时荧光定量PCR试剂盒一步法检测各组海马组织中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1 mRNA的表达水平。 结果 1.水迷宫试验 (1)术前各组大鼠平均逃避潜伏期和跨越平台次数组间差异无显著性(P>0.05);(2)术后第25d~30d,与假手术组比较,VD模型组平均逃避潜伏期明显延长和跨越平台次数显著减少(P0.05)。以上结果提示VD模型大鼠的学习和记忆成绩降低,补阳还五汤可以提高其学习和记忆成绩。 2.光镜下观察大鼠海马CA1区神经元病理学特征 (1)假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞核大而圆,核仁明显,细胞排列致密整齐;(2)相比之下,VD模型组大鼠海马CA1区锥体细胞松散,层次不清,有细胞缺失现象,炎性细胞浸润,部分细胞旁有空染区,核固缩、胞质浓染、胞体变小,并且有胶质细胞增生形成结节;(3)补阳还五汤治疗组和尼莫地平组大鼠海马CA1区锥体细胞排列尚整齐,未发现炎性细胞浸润,核固缩现象较少见。 也许 3.谷氨酸受体免疫组化染色 (1)与假手术组海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1阳性神经元面密度值比较,VD模型组明显减少(P


猪链球菌血清2型(Streptococcus suis serotype2)是一种重要的人畜共患病病原体,猪链球菌

..猪链球菌血清2型(Streptococcus suis serotype2)是一种重要的人畜共患病病原体,猪链球菌感染具有较高的病死和病残率,其最主要的临床症状是脑膜炎,与其它细菌性脑膜炎相似,我们认为猪链球菌致脑膜炎的过程也是多步骤的,其中最关键的步骤是猪链球菌如何穿过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)进入中枢神经系统。 BBB是重要的结构和功能屏障,在维护中枢神经系统(CNS)免受血液中的有害物质和微生物的侵入方面起重要作用,其主要由脑微血管内皮细胞(BMEC)、星形胶质细胞和周细胞组成,而脑微血管内皮细胞是其最主要的组成部分。因此,猪链球菌与脑微血管内皮细胞相互作用的研究对揭示猪链球菌穿过BBB的作用机制,进而研究猪链球菌致脑膜炎的机制均有重要意义。 我们课题组在前期工作中,利用人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3),这一国内外公认的模拟BBB较好的细胞系,建立了人BBB体外模型,并确认了猪链球菌以细胞旁的途径穿过BBB。本研究旨在利用建立的人BBB体外模型,筛选可能影响猪链球菌穿BBB能力的毒力因子,并研究分析其作用机制。本研究筛选了本课题组前期发现的多个可能毒力基因如SSU05_1000,SSU05_MRP,SSU05_1815及SSU05_1664等在猪链球菌穿血脑屏障过程中的作用。实验结果表明,敲除SSU05_1000,SSU05_MRP基因后,猪链球菌穿BBB能力显著下降,而敲除其它毒力基因对猪链球菌穿BBB能力无显著影响。因此,我们推测SSU05_1000,SSU05_MRP很可能在猪链球菌穿BBB过程中发挥重要作用。 时间 SSU05_1000是本课题组新发现的细胞壁蛋白,具有较强的免疫原性。本课题组前期动物实验结果表明:SSU05_1000有助于猪链球菌抵抗免疫细胞的杀伤,从而实现血中存活,有助于细菌进入脑部。但是,具体的作用机制并不清楚,且目前尚未有对该蛋白的研究报道。 为了研究SSU05_1000在猪链球菌穿BBB过程中作用机制,本研究对该基因进行了重组表达和纯化。首先,构建pET30a-SSU05_1000重组表达质粒,并将其转入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中。IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示该蛋白为在细菌裂解液上清中,为可溶性表达,然后利用镍亲和层析法对该蛋白进行纯化,得到纯度90%以上的重组SSU05_1000蛋白,并用TritonX-114去除污染的脂多糖(LPS)。 为了验证SSU05_1000基因在猪链球菌穿血脑屏障过程中的作用,将获得的重组蛋白预处理hCMEC/D3细胞,然后评价05ZYH33△1000的穿过能力。结果表明:SSU05_1000蛋白可以使05ZYH33△1000穿膜能力恢复到05ZYH33野生株水平。为了分析猪链球菌穿血脑屏障过程中激活的信号通路,本研究筛选了多种信号通路的抑制剂。研究结果表明:p38MAPK和JNK通路抑制剂预处理hCMEC/D3细胞后,能显著降低猪链球菌穿血脑屏障能力。提示:猪链球菌在穿血脑屏障过程中可能需要激活MAPK信号通路。在此基础上,本研究进一步研究了SSU05_1000蛋白与MAPK信号通路激活之间的关系。Western blot检测结果显示SSU05_1000可以激活p38,JNK信号通路。 综上所述,本研究结果提示SSU05_1000通过激活p38, JNK信号通路从而破坏BBB的完整性,打开细胞间隙,有助于猪链球菌穿过BBB。软骨内成骨及膜内成骨过程是骨骼形成的两种主要方式。软骨内成骨过程包括软骨雏形形成和骨形成,首先聚集的骨髓间充质细胞分化为软骨细胞,然后开始软骨内成骨过程为软骨细胞增殖、分化和凋亡,凋亡的肥大软骨细胞随新生的血管一同进入成骨细胞,最终以矿化的软骨基质区为中心开始成骨过程。软骨生长板是长骨纵向生长的重要场所,调控长骨的纵向生长速度[1]。 哪里 软骨内成骨过程被很多生长因子所介导的信号通路所调控,其中包括FGFs(Fibroblast Growth Factors,成纤维细胞生长因子)。FGFs要与其特异性的受体FGFR1-4(Fibroblast Growth Factor Receptor,成纤维细胞生长因子受体)结合才能发挥功能。既往研究发现FGFRs突变影响骨发育,对骨细胞的增殖、分化,骨的形成起到关键作用[2-4]。 AS (Apert Syndrome,Apert综合征)是一种人类颅缝早闭综合征,以冠状缝早闭,颅面畸形和手足的并指/趾畸形为典型体征[5-6]。AS90%是由两种FGFR2功能获得性突变,即FGFR2Ser252Trp或者Pro253Arg突变引起,其中67%是FGFR2Ser252Trp[7]。这两种突变都是影响FGFR2免疫球蛋白样结构域II和III之间高度保守区域,使FGFR2可能获得对配体结合范围的扩大,从而使靶细胞的FGFR2信号持续增强[8]。 Cohen,Kreiborg发现AS患者除了骨发育反常外,颅底软骨发育及干骺端软骨等软骨发育也出现发育障碍[6]。不仅如此,在之前建立的FGFR2突变小鼠模型中,也发现软骨内成骨发育异常,导致小鼠身材弱小,四肢及脊柱骨骼发育迟缓及颅底发育不良[9-11]。FGFR2主要其可激活下游MAPK[12-14]和PKC通路[14-15],调控间充质干细胞增殖,影响直接成骨和软骨内成骨过程[11,16]。 我们利用条件打靶技术构建Fgfr2+/S252W模式动物,模拟Apert综合征。我们发现突变小鼠不仅表现出颅缝早闭,还有骨发育迟缓,体形弱小。这与FGFR2受体功能增强对成骨,软骨细胞影响有关。为了证实FGFR2在早期骨发育中的作用,我们利用同窝出生野生型及突变Fgfr2+/S252W小鼠进行比较,在出生后早期对骨发育进行形态、组织学观察及分子水平进行研究并比较两者BMSCs(Bone 还有 Mesenchymal Stem Cells,骨髓间充质干细胞)在软骨内成骨过程中的增殖、分化差异。我们并发现在FGFR2突变引起小鼠骨骼发育异常,可能是由p38及Erk1/2信号通路介导的。 实验结果: 1. FGFR2功能获得性突变使小鼠呈现出类似人类Apert综合征的典型骨骼表型,包括颅骨早闭,圆头畸形,身材矮小,有望成为研究Apert综合征的良好动物模型之一。 2. Fgfr2+/S252W小鼠软骨内成骨发育迟缓,骨量减少导致长骨纵向生长障碍。 3.组织学观察发现FGFR2持续增强导致干骺端生长板增殖、肥大软骨层缩短,抑制生长板细胞增殖,并且表达成软骨、成骨标志蛋白下降。 4. Fgfr2+/S252W突变小鼠骨髓基质细胞体外培养诱导实验提示,FGFR2功能持续增强抑制细胞增殖以及软骨细胞早、中期分化,但增强软骨细胞终末期成骨分化能力,最终抑制细胞矿化能力。 5.

05。 结果 1光镜观察各组大鼠肺组织形态 与正常对照组相比,COPD模型组大鼠气管及支气管粘膜上皮细胞脱落,炎性细胞浸润,支气管

05。 结果 1光镜观察各组大鼠肺组织形态 与正常对照组相比,COPD模型组大鼠气管及支气管粘膜上皮细胞脱落,炎性细胞浸润,支气管平滑肌增厚,胶原沉积,肺泡壁变薄,甚至破裂融合成肺大泡。符合人类COPD气管及肺组织病理学变化。各药物干预组大鼠肺组织破坏程度较COPD组轻,其中红霉素+布地奈德组大鼠肺组织破坏最轻。 2各组大鼠肺功能变化 COPD模型组大鼠,潮气量(TV)、呼气峰流速(PEF)、50%潮气量呼气峰流速(EF50)分别为1.25±0.73ml、18.49±3.24ml/s.1.38±0.21ml/s,显著低于正常对照组[1.87±0.76ml、24.96±11.38ml/s、1.73±1.02ml/s],差异具有统计学意义(P

49±0 45 μmol/L和25 4±1 1pmol/min/mg protein;NC在MDCK-hOCT1/MDCK-hOC

49±0.45 μmol/L和25.4±1.1pmol/min/mg protein;NC在MDCK-hOCT1/MDCK-hOCT3细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC50值分别为0.163±0.027 μmol/L和0.522±0.072 μmol/L。而在mock细胞上IC50值为17.0 ±4.2 μmol/L。OCT1/3抑制剂(+)/(-)-THP均能显著降低NC的细胞毒性;经0.5μmol/L NC处理,MDCK-hOCT1和MDCK-hOCT3细胞存活率分别降低至空白对照组的17.5±4.7%和55.4±3.8%,50μmol/L的(+)/(-)-THP使MDCK-hOCT1细胞存活率分别升高至对照组的45.6±1.2%和51.6±2%,使MDCK-hOCT3细胞存活率升高至对照组的89.1±5.3%和86.1±7.0%。在大鼠原代肝细胞模型上也观察到(+)/(-)-THP对NC诱发的肝细胞毒性的减弱作用。NC在MDCK-hMATE1细胞上的积聚显著高于mock细胞,其Km、Vmax及Clint分别为0.897±0.085 很少 nmol/L,18.5±1.0 pmol/mg protein/min,为20.6mL/mg protein/min。然而,MATE1对NC的转运能力(Clint:20.6 mL/mg protein/min)明显低于OCT1(Clint:311 mL/mg protein/min)。结论:OCT1,OCT3通过介导NC的细胞摄取,在其致肝细胞毒性中发挥重要作用;(+)/(-)-THP通过抑制OCT1,OCT3介导的细胞摄取而减弱NC的肝细胞毒性。MATE1对NC的转运能力低于OCT1,推测肝细胞中由hOCT1和hOCT3介导的NC摄取大于hMATE1介导的外排。第三章CYP450对Nitidine的代谢解毒作用背景和目的:第二章实验结果显示,NC在大鼠原代肝细胞上的毒性明显低于稳定高表达OCTs的MDCK细胞上的毒性,我们推测原代肝细胞中OCTs表达可能低于稳定转染细胞,推测原代肝细胞中P450酶(CYP450)可能介导NC代谢,从而降低NC的细胞毒性。因此,本章研究CYP酶对NC的代谢及在其肝细胞毒性中的作用。方法:应用人肝微粒体代谢酶表征实验和人重组酶验证,阐明参与NC肝脏代谢的主要CYP酶亚型;比较NC对MDCK-hOCT1细胞及hOCT1与hCYP3A4双转细胞(MDCK-hOCT1/hCYP3A4)的毒性差异,以及CYP3A4抑制剂对NC致MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞毒性的影响,阐明CYP酶对NC的代谢解毒作用。结果:CYP3A4, 那个 CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的肝脏代谢。NC (0.25-10 μmol/L)对MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞的毒性明显低于对MDCK-hOCT1细胞的毒性;CYP3A4抑制剂,氟康唑和红霉素,显著增强NC在MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞上的毒性,提示CYP3A4通过介导NC代谢而减弱NC的毒性。结论:肝脏CYP3A4, CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的一相代谢;CYPs,如CYP3A4,可通过介导NC的肝脏代谢而降低其肝细胞毒性。第四章Nitidine在大鼠体内的药动学和组织分布研究背景和目的:前述研究考察NC在转基因细胞模型及原代肝细胞模型上的摄取及细胞毒性,本章主要考察单次口服和尾静脉注射后,NC在大鼠体内的药动学过程,并计算其口服生物利用度,以推测口服给予NC后在体内是否会引起毒性。同时考察单次及连续20天静脉注射NC (5mg/kg)后,其在大鼠体内的组织分布,以阐明NC分布的组织特异性及连续给药可能由OCTs介导NC细胞摄取发生的组织蓄积现象,为NC的体内毒性提供药动学依据。方法:建立快速、准确、灵敏的LC-MS/MS法测定生物样本中的NC,并将此方法用于测定大鼠口服10mg/kg或尾静脉注射2 mg/kgNC后的血浆药物浓度,计算其口服生物利用度;比较单次静脉注射5 mg/kg NC与相同剂量连续给药20天后相应组织的分布差异。结果:大鼠口服10 mg/kg NC后,血药浓度低,其绝对生物利用度仅为4.8%。鉴于口服NC的生物利用度低,本章考察了大鼠单次静脉注射5 mg/kg NC后的组织分布,结果显示,给药后0.25 h、0.5 h及2h,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度远远高于其在血浆中的浓度,组织与血浆的浓度比值为9.2-2852;以5mg/kg/day的剂量连续静注20天,末次给药后2h,心脏、肝脏、肾脏及小肠中NC的浓度均高于单次给药后相应组织中的浓度。结论:NC的口服生物利用度低,推测其口服后产生毒性的可能性较小。单次静脉注射NC后,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度高于其在血浆中的浓度。因此,推测大鼠连续静注NC,可能会产生组织蓄积而引起一定的毒性。第五章Nitidine连续给药后大鼠体内的毒性研究背景和目的:前几章研究显示,由于肝脏细胞中OCT1/3介导NC的细胞摄取,导致NC较强的肝细胞毒性。但NC经口给药后绝对生物利用度低,而静脉注射后组织分布研究表明,NC在不少组织中的浓度显著高于血浆中浓度,且连续给药后,在大鼠肝脏、肾脏及心脏等脏器存在蓄积现象,提示连续给药NC在大鼠体内可能引起脏器毒性或整体毒性。因此,本章考察大鼠连续静脉注射NC后的毒性,为NC的研发提供参考。方法:Sprague-Dawley大鼠连续20天静脉注射5 点击此处 mg/kg/day NC,观察其一般活动行为、体重、检测血清生化指标,组织病理学检查,综合评价NC在体内的整体毒性。以MDCK-hOCT2和mock细胞为模型,采用MTT法及检测细胞培养液中LDH活性的方法,对hOCT2介导的NC细胞毒性以及OCT2抑制剂,(+)/(-)-THP和西咪替丁,对其细胞毒性的减弱作用进行考察。结果:NC可引起大鼠食欲减退,体重减轻,血清LDH值和BUN值明显升高,分别为给药前的2.1倍和1.4倍,ALP值显著降低至给药前的1/5,且组织病理学检查观察到肾小管产生空泡变性,未发现NC在大鼠体内对其它受检脏器引起毒性。此外,NC在MDCK-hOCT2细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC5o值分别为0.556±0.083 μmol/L及17.0 ±4.