Monthly Archive: December 2016

4分化成熟的影响以及NF-κB信号通路在该激活效应中的作用。方法:1、采用MTT法检测拟康氏木霉胞外多糖(EPS)对小鼠树突状细胞

4分化成熟的影响以及NF-κB信号通路在该激活效应中的作用。方法:1、采用MTT法检测拟康氏木霉胞外多糖(EPS)对小鼠树突状细胞系DC2.4细胞存活率的影响,以不同浓度EPS处理DC2.4细胞24 h后检测。2、用一定浓度的拟康氏木霉胞外多糖(EPS)处理静息状态下的DC2.4细胞,在不同时间点取样封片,倒置显微镜观察EPS引起细胞形态的变化。3、用流式细胞仪检测EPS处理前后DC2.4细胞表面分子CD11c、CD86、CD80、MHC-II表达情况以及细胞吞噬活性的变化。4、用酶联免疫吸附实验检测EPS处理后细胞因子IL-12p70分泌量的变化。5、采用免疫荧光染色技术观察EPS促使DC2.4细胞核转录因子NF-κB亚基p65发生核移位。6、用EPS处理DC2.4细胞后裂解细胞提取胞质蛋白用Western 无 blotting技术检测NF-κB的抑制蛋白IκBa的降解和丝裂原活化蛋白激酶p38MAPK的磷酸化。7、用NF-κB和p38MAPK的抑制剂(BAY 11-7082、SB 203580)预处理细胞后再与EPS一起孵育取上清,检测IL-12p70含量与EPS单独处理时的差异。结果:1、MTT法检测发现EPS在2.5~400μg/mL剂量范围内对DC2.4细胞无明显细胞毒性。2、对照组DC2.4细胞呈半贴壁状态,形状不规则呈星形、蝌蚪形或梭形,加入EPS处理10 h后,与对照组相比,细胞树突分支增加、增粗、近圆形,由小渐大,多边形或具有规则的多分支的长突起。3、流式细胞仪检测结果显示经EPS诱导后,细胞表面分子的表达率为CD11c35.31%、CD86 43.49%、CD80 64.21%、MHC-II 53.66%,与空白对照组(RPMI-1640组)相比均有明显升高;流式细胞仪检测DC2.4对FITC-dextran吞噬作用结果显示,EPS组为27.38%,与空白对照组(RPMI-1640组)相比吞噬作用明显下降。4、酶联免疫吸附实验结果显示,EPS组含量为151 pg/mL,与空白对照组(RPMI-1640组)相比能显著提高细胞因子IL-12p70分泌量。5、免疫荧光染色技术显示,对照组DC2.4细胞内p65亚基荧光多分布松散,荧光强度较弱;而经EPS处理后,DC2.4细胞内p65亚基荧光多分布集中于核,荧光强度较强,表明EPS可以促使p65亚基发生核移位,激活核转录因子NF-κB。6、Western 不 blotting结果显示EPS可以明显促使IκBa发生降解,p38MAPK发生磷酸化,提示EPS表明可以激活DC2.4细胞中的核转录因子NF-κB和p38MAPK。7、抑制剂(BAY 11-7082、SB203580)预处理细胞后,结果显示IL-12p70含量与EPS单独作用相比时显著下降,下降幅度分别为46.34%、42.68%,表明EPS可以通过NF-κB和p38MAPK两条信号转导通路来激活DC2.4细胞。结论:1、EPS能够促进DC2.4细胞分化成熟,上调DC2.4细胞表面分子CD11c、CD86、CD80、MHC-II的表达。2、EPS抑制DC2.4细胞对FITC-dextran的吞噬。3、EPS能够促进DC2.4细胞分泌IL-12p70。4、EPS通过NF-κB和p38MAPK信号转导通路来上调DC2.4细胞的免疫活性。目的 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是临床常见的能够引起肺炎、脑膜炎、中耳炎和败血症的革兰阳性菌。在发展中国家肺炎链球菌性败血症致死占5岁以下儿童可预防性死亡的25%,每年导致120多万婴儿死亡。肺炎链球菌的溶血素(Pneumolysin,PLY)在细菌致病和诱导宿主防御应答中发挥重要作用,但是目前对宿主防御肺炎链球菌溶血素的分子机制尚不十分清楚。 细菌入血后,血液中的免疫细胞会与细菌及产物发生直接作用或者与感染组织分泌的信号分子发生间接的相互作用,从而引发宿主免疫防御。在这一过程中,单核细胞在机体的免疫防御中发挥了重要作用。但是目前关于单核细胞与PLY相互作用机制的研究少有报道,所以本文采用人急性单核细胞白血病单核细胞株(human acute monocyticleukemia cell line,THP-1)与PLY在体外共孵育的方式来初步探讨单核细胞与PLY相互作用的机制,研究单核细胞凋亡情况及凋亡通路信号分子的变化情况,为进一步研究PLY触发宿主瞬时和早期固有免疫应答机制奠定基础。 无 方法 1.采用下述实验方法研究PLY对THP-1细胞生长状态的影响:MTT法测定PLY对THP-1细胞的增殖抑制情况;瑞氏染色观察PLY对THP-1细胞形态的影响;透射电子显微镜观察PLY诱导THP-1细胞亚细胞结构改变情况;流式细胞术检测细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA片段化现象;同时将△A146PLY(PLY的第146位氨基酸发生缺失突变,无溶血活性)处理组作为阴性对照。 2.从以下几方面初步探讨PLY诱导THP-1细胞凋亡的免疫机制:分光光度法测定Caspase3,8,9活性;免疫细胞化学方法测定凋亡相关蛋白Bax、Bcl-xl及信号分子p38MAPK蛋白表达的变化;通过Western-Blot进一步验证p38MAPK总蛋白表达水平及其磷酸化水平变化;p38MAPK抑制剂处理后通过流式细胞术测定THP-1细胞凋亡率变化情况;同时将△A146PLY处理组作为阴性对照。 结果 1.将THP-1细胞分别与0.05、0.1、0.5、1、2.

57、593 3、558 47μg/ml*h, CL分别为1 003、0 380、0 589(mg)/(μg/ml)/h。与CPT

57、593.3、558.47μg/ml*h, CL分别为1.003、0.380、0.589(mg)/(μg/ml)/h。与CPT组相比较,偶联物组AUC约提高了两倍,消除速率CL明显降低。 针对聚轮烷载体的优势以及喜树碱的作用效果、现有剂型的缺点等方面,本实验合成了以聚轮烷为载体的聚轮烷—喜树碱偶联物给药体系,并从偶联物的表征,含量、溶解度以及体外释放度的测定、体内外抗肿瘤试验的等方面进行了研究。研究结果表明,聚轮烷—喜树碱偶联物给药体系有良好的溶解度,大大改善了喜树碱难溶的缺点;体外释放结果表明其具有良好的缓释效果,体内外抗肿瘤试验表明,偶联物对肿瘤细胞及实体瘤有明显的抑制作用;生物利用度是药物制剂质量的一个重要指标,静脉注射偶联物药物代谢动力学研究结果表明,偶联物的AUC大大提高,半衰期延长,有效促进了药物的生物利用度。研究背景与目的 有 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)是我国南方省份及东南亚高发的一种恶性肿瘤,具有明显的种族聚集性和地域性。其发生是一个多阶段、多途径、多机制的过程。流行病学调查显示,鼻咽癌的发生涉及到遗传倾向性和环境致癌因素,很可能是遗传易感性个体接受了致癌物的作用而发生的。EB病毒(EBV)、化学致癌物和胚性击中(即遗传因素或自发突变)构成NPC的主要病因,而发病阶段至少在两个以上。各种环境因素、EBV感染、遗传和表遗传学的改变导致瘤基因过表达及抑瘤基因表达下调或缺失,经过癌前病变,最终发生鼻咽癌。 肿瘤的生成涉及多种基因和基因以外的变化,任何单独一种基因的改变不足以致瘤,多种基因变化的积累才能引起控制细胞生长和分化的机制紊乱,使细胞的生长失控而瘤变。在这些基因的变化中,最常发生两类基因的异常变化,即瘤基因及肿瘤抑制基因。鼻咽癌的生成同样涉及多基因的表达改变。在过去几十年中,虽然我们对于鼻咽癌发生的分子基础认识已经有了很大的提高,但这些认识还是远远不能完全揭示鼻咽癌的发病机理。因此,鼻咽癌相关新基因的发现和研究仍将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机理。 NESG1基因(Genbank AF094758),官方名为CCDC19(NM_012337.1),是本课题组姚开泰教授指导的博士生黎众魁于1999年利用mRNA差异显示法,从人正常鼻咽上皮和软腭口腔上皮中筛选,并结合3′-RACE和5′-RACE技术,分别扩增出长约1.4kb和0.7kb的片段(其中包含了一段174bp的重叠产物以确认扩增的特异性),拼接后发现的一个全长约1850bp连续的cDNA序列。该基因位于1q22。预测其编码框长1161bp,编码386个氨基酸,分子量为46252Da,蛋白质等电点为9.99,SOSUI和PSORTⅡ网上预测其为可溶性核蛋白。BLAST比对发现,NESG1的cDNA序列与胎儿肺组织cDNA文库和Stratagene肺癌cDNA文库中的两个EST序列同源。多组织(包括鼻咽粘膜、气管、食管、大脑、心脏、膀胱、肝脏、肺脏、胃、肾脏、胸腺和大肠)Northern杂交显示,该基因特异性的表达于鼻咽和气管纤毛柱状上皮。 MDV3100分子重量 本课题在此研究基础上,对NESG1基因进行重新克隆测序分析及功能鉴定,并寻找NESG1基因相关的信号转导通路,探讨该基因在鼻咽癌中的作用机制,为进一步阐明鼻咽癌发病机理提供参考。 研究内容与方法 1. NESG1基因的序列修正以及新序列的生物信息学分析 对NESG1基因进行了重新克隆、测序分析并对其序列进行修正,重新预测编码框。对新校正序列进行生物信息学分析。 2. NESG1基因在鼻咽癌中表达水平检测 (1).NESG1基因mRNA表达水平 利用RT-PCR和Real-time PCR检测NESG1 mRNA在鼻咽癌细胞、鼻咽癌组织与非癌鼻咽组织中的表达情况;原位杂交检测NESG1基因的mRNA表达定位。 (2).NESG1兔抗人多克隆抗体制备及NESG1蛋白表达 构建pGEX-4T-1-NESG1-GST原核融合表达载体。IPTG诱导NESG1-GST基因融合表达。利用GST抗体纯化融合蛋白用于免疫大白兔,约100天后取兔血上清,并亲和纯化,最后获得所需的NESG1多克隆抗体。利用免疫组化和Western blot检测NESG1蛋白在鼻咽癌组织与非癌鼻咽组织中的表达情况。利用免疫组化检测鼻咽外多组织中NESG1的表达分布。 3. NESG1基因在鼻咽癌中的功能初步研究 (1).NESG1过表达对鼻咽癌细胞5-8F生物学特性的影响 构建与增强型绿色荧光蛋白融合表达的NESG1慢病毒载体,利用293FT细胞包装成成熟的慢病毒颗粒,感染具有高成瘤和高转移能力的鼻咽癌细胞5-8F。96孔板有限稀释法挑选阳性单克隆细胞,扩大培养,建立稳定过表达NESG1的鼻咽癌细胞株,以空载体同时进行病毒包装及感染鼻咽癌细胞5-8F,获得对照细胞株。利用MTT法、平板克隆形成实验、流式细胞术、Transwell小室迁移实验及Boyden小室侵袭实验等检测NESG1基因在细胞水平对细胞生长、细胞周期、迁移及侵袭能力的影响;检测稳定过表达NESG1的鼻咽癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的改变。 (2).抑制NESG1表达对鼻咽癌细胞5-8F生物学特性的影响 点击此处 构建靶向NESG1的shRNA慢病毒干扰载体,稳定干扰过表达NESG1基因的鼻咽癌细胞,利用MTT法、平板克隆形成实验、Transwell小室迁移实验及Boyden小室侵袭实验等观察NESG1表达抑制后细胞生长、迁移及侵袭能力的变化。进一步探讨NESG1基因在鼻咽癌细胞中的基本功能。 4. NESG1基因介导的分子基础初步研究 (1).应用Affymetrix全基因组芯片检测NESG1基因稳定导入前后对鼻咽癌细胞基因表达的影响,寻找差异表达基因 (2).利用生物信息学的方法,分析基因芯片差异表达基因介导的信号通路 (3).NESG1抑制细胞周期进展的初步分子机制 由于过表达的NESG1能阻滞细胞周期由G1向S期转化,因此,NESG1参与抑制了细胞周期的进展。基于基因芯片的数据,我们利用荧光定量RT-PCR和Western blot验证了S期相关的几个重要基因CCNDl、CCNAl、CDK4、p21、CDK2、CDC2的表达,初步探讨了NESG1基因抑制细胞周期进展的机制。 结果 1….
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5, 5 ,25,50和100μmol/L的无血清培养基培养U266细胞。各组细胞根据检测方法的要求分别培养于培养瓶中,30min

5, 5 ,25,50和100μmol/L的无血清培养基培养U266细胞。各组细胞根据检测方法的要求分别培养于培养瓶中,30min后收集培养细胞待检。 2.检测指标: (1)Western blot技术测定IκB上游激酶IKKα, IKKβ的表达和磷酸化情况; (2)Western blot技术测定胞浆提取物中IκBα蛋白表达和磷酸化水平; (3)细胞免疫荧光染色技术分析NF-κB/p65蛋白在细胞中的表达和分布; (4)Western blot技术测定胞核提取物中NF-κB /p65蛋白表达水平; (5)Transcription Factor Assay kit试剂盒(酶联免疫吸附技术(ELISA))测定胞核提取物中p65蛋白与DNA靶序列结合能力。 结果 1.氯化镧对LPS诱导的巨噬细胞NF-κB信号通路中关键分子表达和/或活化的影响: (1)氯化镧对LPS诱导的NF-κB活化的抑制作用:氯化镧(2.5μmol/L)能够显著抑制LPS诱导NF-κB/p65自胞浆转位到细胞核,并且显著减弱NF-κB/p65与靶DNA结合活性。 (2)氯化镧对LPS诱导的IκBα降解的抑制作用:氯化镧显著抑制LPS诱导的胞浆IκBα降解,从而抑制了NF-κB/p65自胞浆转位到细胞核。 AZD4547 价格 (3)氯化镧对LPS诱导的IκBα磷酸化的抑制作用:氯化镧不能阻断LPS介导的RAW264.7巨噬细胞中IκBα的磷酸化。 (4)氯化镧对LPS诱导的IKKs活性的影响:氯化镧不影响RAW264.7巨噬细胞中IKKα/β表达和磷酸化水平,从而不能阻断LPS介导的IκBα的磷酸化。 在RAW264.7细胞株中,NF-κB激活剂LPS诱导IKKβ及IκBα磷酸化,令IκBα降解,最终使NF-κB/p65转位入核与靶基因结合。氯化镧虽然不能阻断IKKβ及IκBα磷酸化,但是能够阻止RAW264.7细胞中IκBα的降解,并抑制NF-κB/p65转位入核并抑制NF-κB/p65与靶基因的结合活性,最终阻断NF-κB信号转导通路。 BGB324 2.氯化镧对TNF-α诱导的Hela细胞NF-κB信号通路中关键分子表达和/或活化的影响: (1)氯化镧对TNF-α诱导的NF-κB活化的抑制作用:25-100μmol/L氯化镧能够显著抑制TNF-α诱导NF-κB/p65蛋白表达水平并抑制其自胞浆转位到细胞核,5-100μmol/L氯化镧还能显著减弱Hela细胞中NF-κB/p65与靶DNA结合活性,上述抑制效应呈剂量依赖关系。 (2)氯化镧对TNF-α诱导的IκBα磷酸化和降解的抑制作用:TNF-α能够诱导Hela细胞中IκBα的磷酸化和降解。随着氯化镧处理的浓度不断升高,IκBα表达水平逐步升高,而磷酸化水平不断降低。表明氯化镧能够抑制TNF-α诱导的IκBα的磷酸化和表达水平的降低,且该效应随着随着氯化镧浓度的升高而逐步增强。 (3)氯化镧对LPS诱导的IKKs活性的影响:氯化镧不影响Hela细胞中IKKα/IKKβ蛋白的表达水平。静息状态的Hela细胞几乎不表达p-IKKβ,而在TNF-α诱导下p-IKKβ水平则明显升高,随着氯化镧处理浓度的逐渐升高,p-IKKβ水平逐步下降,50-100μmol/L氯化镧能够显著抑制TNF-α诱导Hela细胞中IKKβ的磷酸化。 很少 NF-κB的另一个激活剂TNF-α,亦通过磷酸化IKKβ及IκBα,导致IκBα降解,最终亦使NF-κB/p65转位入核与靶基因结合,启动相关基因的表达。在Hela细胞株中,氯化镧不仅能够抑制IκBα的降解和NF-κB/p65转位入核,阻断NF-κB/p65与靶基因的结合,还能够阻断IKKβ及IκBα磷酸化。可见在不同细胞及激活条件下,氯化镧抑制NF-κB信号通路的靶点不完全相同。 3.氯化镧对U266细胞中NF-κB的组成性活化(constitutive activation)的影响: (1)氯化镧对NF-κB组成性活化的作用:0-100μmol/L的氯化镧不能抑制NF-κB的组成性活化,逆转p65蛋白的移位。 (2)氯化镧对U266细胞中IκBα蛋白的表达和磷酸化的作用:0-100μmol/L氯化镧亦不能影响IκBα蛋白的表达和磷酸化水平。 (3)氯化镧对U266细胞中IKKs活性的影响:0-100μmol/L的氯化镧对U266细胞中IKKα/IKKβ蛋白的表达和磷酸化水平影响不明显。 (4)氯化镧在胞外条件下,对U266细胞核提取物中NF-κB/p65与DNA的结合能力的影响:实验表明在细胞外条件下,5μmol/L氯化镧即能够显著抑制p65蛋白与靶DNA结合活性,并且该抑制效应随着氯化镧浓度的增高不断增强,100μmol/L氯化镧能够完全抑制胞核提取物中NF-κB/p65与靶DNA的结合。研究结果提示:对于NF-κB组成性活化U266细胞,氯化镧不影响IKKβ的磷酸化及IκBα的磷酸化和降解,并无法逆转NF-κB转位,但能够在细胞外条件下阻断NF-κB/p65与靶DNA的结合。 第III部分氯化镧对LPS诱导NF-κB调控的炎症介质表达的影响目的通过观察氯化镧对LPS诱导的炎性因子TNF-α、NO及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)表达水平及活性的作用,了解氯化镧对LPS诱导NF-κB下游靶基因表达的影响。…
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建立小鼠细粒棘球蚴感染模型,实验组用原头蚴感染BALB/c小鼠,对照组小鼠腹腔注射同体积的PBS;分别于第1、3、5、7、9、12

建立小鼠细粒棘球蚴感染模型,实验组用原头蚴感染BALB/c小鼠,对照组小鼠腹腔注射同体积的PBS;分别于第1、3、5、7、9、12天处死后,用流式细胞仪检测脾细胞中T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+T细胞的含量及NK细胞的活性受体NKG2D的表达;qRT-PCR法检测Foxp3mRNA和TGF-β1mRNA的相对表达量;Yac-1作为靶细胞与小鼠脾细胞共培养,用LDH法检测小鼠NK细胞对Yac-1的裂解率,观察脾细胞的杀伤活性。 2.建立小鼠细粒棘球蚴感染模型,并用抑制剂特异性阻断TGF-β1受体,于第9天处死后用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+T细胞的含量及NK细胞的活性受体NKG2D的表达;用LDH法检测脾细胞的杀伤活性;Western Bolting检测细粒棘球蚴对TGF-β/Smad的信号通路的影响。 结果 1.在细粒棘球蚴感染早期,CD4+CD25+Foxp3+T比值增高:与对照组相比小鼠CD4+/CD8+T细胞比值逐渐下降;随着感染时间的延长,CD4+CD25+T细胞数量呈逐渐增高;Foxp3在基因水平上的表达呈增高的趋势;与对照组相比,除感染后第1天无统计学差异外,其他的均有统计学差异(P0.05);B、E、F组mRNA和蛋白表达均不同程度上调(P<0.05),其中B组上调尤明显;D组mRNA与蛋白表达均明显低于B、E、F组(P<0.05),与C组无明显差异(P>0.05);F组mRNA高于E组(P<0.05),但蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。 5.Smad2:免疫着染显示主要表达于胞浆;C组mRNA和蛋白表达与A组无统计学差异;B、E、F三组mRNA和蛋白水平均有不同程度表达上调(P0.05);F组mRNA表达高于E组(P<0.05),蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。 6.Smad7:免疫着染显示主要表达于胞浆;C组mRNA和蛋白表达与A组无统计学差异(P>0.05);B、D组mRNA和蛋白水平均有不同程度表达下调(P

1nM、1nM、10nM、30nM)处理脐静脉内皮细胞24小时后,种于matrix胶,37℃孵育16-18小时,显微镜下观察并拍照

1nM、1nM、10nM、30nM)处理脐静脉内皮细胞24小时后,种于matrix胶,37℃孵育16-18小时,显微镜下观察并拍照; (2)不同浓度的血管紧张素Ⅱ(OnM、0.1nM、1nM、10nM、30nM)处理脐静脉内皮细胞24小时后,收集胞浆蛋白,Western Blot法检测GRP78、IRE1、JNK蛋白水平的表达; (3)不同浓度的AT1受体拮抗剂氯沙坦(1uM、3uM、10uM)、AT2受体特异性抑制剂PD123319(10μM)预处理HUVEC1小时后,再加入1nM AngⅡ处理24小时,及PD123319(10μM)、氯沙坦(10uM)单独处理HUVEC24小时后,收集细胞,种于matrix胶,37℃孵育16-18小时,显微镜下观察并拍照; Wortmannin订单 (4)氯沙坦(10μM)、IRE1特异性抑制剂irestatin9389(2.5μM)、JNK特异性抑制剂SP600125(10μM)、p38MAPK特异性抑制剂SB203580(10μM)预处理HUVEC1小时后,再加入1nMAngⅡ处理24小时,收集细胞,matrix胶上行血管生成试验,显微镜下观察并拍照; (5)氯沙坦(10μM)、irestatin9389(2.5μM)、SP600125(10μM)、SB203580(10μM)预处理HUVEC1小时后,再加入1nM AngⅡ处理24小时,及1nM AngⅡ单独处理24小时后,收集胞浆蛋白,Western Blot法检测GRP78、IRE1、JNK、VEGF、p38MAPK的表达; (6)氯沙坦(10μM)、irestatin9389(2.5μM)、SP600125(10μM)、SB203580(10μM)预处理HUVEC1小时后,再加入1nMAngⅡ处理24小时,及1nM AngⅡ单独处理24小时后,提取细胞RNA,采用半定量PCR检测GRP78、IRE1、JNK的转录水平。 结果:(1)AngⅡ诱导内皮细胞的血管生成并触发内质网应激:AngⅡ(0.1nM、1nM、10nM、30nM)可促进内皮细胞血管生成,且呈抛物线样浓度相关性,以1nM时血管生成最为显著;与促血管生成效应一致,AngⅡ (0.1nM、1nM、10nM、30nM)明显增加内皮细胞GRP78、IRE1、JNK蛋白水平的表达,且以1nM时最为显著; (2) AngⅡ通过AT1受体介导内皮细胞的血管生成:AT1受体拮抗剂氯沙坦(1μM,3μM,10μM)呈浓度依赖性的抑制AngⅡ诱导的血管生成,10μM时抑制作用最为明显;而AT2受体特异性抑制剂PD123319(10μM)对AngⅡ诱导的血管生成无明显作用; 没有 (3)AT1受体/内质网应激途径在AngⅡ诱导的内皮细胞血管生成中的作用:AT1受体拮抗剂氯沙坦、IRE1特异性抑制剂irestatin9389、JNK特异性抑制剂SP600125、p38MAPK特异性抑制剂SB203580均能抑制AngⅡ诱导的血管生成; (4)AT1受体/内质网应激途径对AngⅡ诱导的VEGF表达的作用:AngⅡ显著增加VEGF蛋白水平的表达,而氯沙坦、irestatin9389、SP600125、SB203580均能不同程度的抑制AngⅡ诱导的VEGF蛋白水平的表达; (5) AngⅡ与AT1R/IRE1/JNK/p38MAPKs途径的关系:氯沙坦可抑制AngⅡ诱导的GRP78蛋白水平及mRNA的表达,而irestatin9389、SP600125、SB203580均无此抑制作用;氯沙坦、irestatin9389均能抑制AngⅡ诱导的IRE1蛋白水平及mRNA的表达,而SP600125、SB203580对IRE1的表达无影响;氯沙坦、irestatin9389、SP600125均能抑制AngⅡ诱导的JNK蛋白水平及mRNA的表达,而SB203580对此无影响;以上所有抑制剂均能抑制AngⅡ诱导的p38MAPK蛋白水平的表达。 结论:AngⅡ可通过AT1受体激活内质网应激IRE1/JNK/p38MAPK通路上调VEGF蛋白水平表达,从而诱导HUVEC的血管生成。目的: 探讨硫化氢(H2S)、SB203580对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖、凋亡的影响,研究P38MAPK信号通路在H2S影响大鼠肝星状细胞(HSC)增殖、凋亡中的作用,探讨H2S是否通过P38MAPK信号通路起到抗肝纤维化作用。 方法: (1) HSC-T6细胞的培养:以10%胎牛血清DMEM(高糖)培养基培养,接种后6-8h细胞贴壁,24h-48h换液,72h增殖达生长面积90%消化传代,细胞传代周期稳定用于实验。(2) 购买NU7441 MTT法检测HSC-T6细胞的增殖:分对照组与实验组,实验组按照加药浓度梯度分组:NaHS组分别按照25umol/L、50umol/L、75umol/L、100μmol/L、200μmol/L浓度梯度给药,SB203580组分别按照10umol/L、25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L的浓度梯度给药,均干预48h,加入MTT20μl暗处反应4h,加入DMSO150μl终止反应,使用酶标仪于570nm波长处检测各孔吸光度(A)值。(3)流式细胞术检测H2S与SB203580对HSC-T6细胞凋亡的影响:分5组,正常对照组、DMSO组、NaHS50μmol/L组、SB20358075μmol/L组(SB组)、SB20358075umol/L+NaHS50umol/L组(SB+NaHS组),采用流式细胞仪经Annexin V-FITC/PI双染检测各组细胞HSC-T6细胞的凋亡率;同等实验条件,Hoechst33342染色,倒置荧光显微镜下观察并计算HSC-T6细胞的凋亡率。(4)逆转录PCR法检测HSC-T6细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达:实验分对照组、DMSO组、NaHS组、SB组、SB+NaHS组,提取HSC-T6细胞中总RNA,逆转录PCR法检测细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达。(5)Western blot法检测HSC-T6细胞中P-P38、Caspase-3蛋白的表达:实验分对照组、DMSO组、NaHS组、SB组、SB+NaHS组,Westernblot法检测细胞中P-P38、Caspase-3蛋白的表达。 结果: (1)HSC生长良好,总体死亡率

采用线栓法制作小鼠和大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型(middle cerebralartery occlusion,MCAO),脑缺

采用线栓法制作小鼠和大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型(middle cerebralartery occlusion,MCAO),脑缺血2 h再灌注24 h后进行小鼠神经功能缺失评分;干湿法测定脑含水量;TTC染色显示大鼠再灌注后的梗塞灶,计算梗塞灶体积;测定血清和脑组织中LDH活力、MDA和NO含量及脑组织中SOD和GSH-PX活力;用RT-PCR法测定脑缺血再灌注后梗塞半球的iNOS、nNOS、eNOS 很少 mRNA表达的变化。 2.采用Pulsinelli等介绍的四血管结扎法(4-vessel occlusion,4-VO)建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。记录脑缺血前、缺血10 min和再灌注后5min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min的脑电图改变;采用HE染色法观察脑组织病理结构改变,进行脑组织病理评分;检测血清中LDH活性和NSE含量的变化;采用蛋白免疫印迹方法;测定大鼠脑皮质和海马组织中ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2在脑缺血再灌注后表达的变化,以及TFR对此变化的影响。 3.采用大鼠原代培养的海马神经元缺氧4 h再复氧24 h模型。用MTT染色来评价神经元存活率;收集细胞上清液,进行LDH活性、NO和MDA含量测定;以Fluo-3/AM染色观察海马神经元内Ca~(2+)的变化。 4.在海马细胞缺氧前分别用脑血管段和脑微血管内皮细胞预处理,然后行海马神经元MTT染色率和上清液中LDH活性、NO含量的测定。 结果: 1.在小鼠MCAO模型上,TFR(30、60、120 mg/kg)能明显改善神经功能障碍(P<0.05,P<0.01),明显降低缺血侧脑组织的含水量,使缺血侧脑水肿明显减轻(P<0.01),显著降低血清中LDH活性,MDA含量和NO含量(P<0.05,P<0.01)。 2.在大鼠MCAO模型上,TFR(15、30、60 mg/kg)缺血再灌注半球梗塞体积百分比减小(P<0.05),使脑组织中LDH活性和MDA含量及NO含量下降,SOD和GSH-PX活性均升高(P<0.05,P<0.01)。 可能 3.在大鼠4-VO模型上,脑缺血时大鼠的脑电图幅度迅速下降,再灌注后脑电幅度逐渐恢复。TFR(15、30、60 mg/kg)在再灌注5 min时脑电图幅度与NS组比较无差异:在再灌注10 min、15 min和30 min时TFR(15、30、60 mg/kg)脑电图幅度尽管比NS组幅度高,但无统计学意义;再灌注45 min和60 min时,TFR(15、30、60 mg/kg)脑电图幅度与NS组比较有显著差异(P<0.05,P<0.01)。结果提示TFR可促进再灌注时大鼠脑电的恢复。同时TFR(15、30、60 mg/kg)能不同程度地改善脑缺血再灌注大鼠脑组织病理结构的改变,能减少血清中LDH的活力和NSE的含量(P<0.05,P<0.01)。 4.在大鼠局部脑缺血2 h再灌注24 h模型上,30和60 mg/kg…
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