Monthly Archive: January 2017

目的通过对比多发性骨髓瘤(MM)患者不同国际分期系统(ISS)中C-反应蛋白(CRP)、血红蛋白(Hb)、红细胞沉降率(ESR)水平的差异,以及对CRP、Hb、ESR水平与瘤细胞所占比例、β2-微球蛋白(β2-MG)水平作相关性分析,探讨三项指标在MM中的变化及临床意义。 方法选取青海省人民或者医院血液内科2006年~2010年收治的30例有完整诊疗记录的新诊断MM病例资料,逐一记录首次入院的实验室检查指标及相关临床指标,按照ISS分期标准进行分期。选取同期住院的30例年龄、性别、Hb水平相仿的巨幼细胞贫血(MA)病例资料作为对照组,逐一记录相关的实验室检查指这个标及临床指标。不同ISS分期的CRP、Hb、ESR水平比较采用单因素方差分析,MM组与MA组的CRP、ESR水平比较采用两样本t检验,MM组无合并症与合并症组CRP、Hb、ESR、β2-MG水平比较采用两样本t检验,CRP、Hb、ESR与瘤细胞所占比例的相关性采用SpeAlisertib 花费arman相关,与β2-MG水平的相关性采用Pearson相关。 结果MM组CRP、Hb、ESR水平Ⅱ期与Ⅰ期比较P>0.05,无统计学差异,Ⅲ期与Ⅰ期、Ⅱ期比较P

在肝癌肺转移的裸鼠模型中,抑制Src激酶的活性未能抑制肝癌原发瘤的大小,但明显抑制了肝癌肺转移。体内体外实验均提示：抑制Src激酶的活性可明显抑制下游磷酸化信号FAK及Stat3的表达。 结论：Src激酶与肝癌的侵袭相关,转移潜能越高,Src激酶表达越高；抑制Src激酶活性能明显抑制肝癌的肺转移。Src激酶通过调节下游FAKStat3的磷酸化信号调节肝癌细胞转移功能。有Src激酶是调节肝癌转移的重要靶基因,对Src激酶的调控可成为肝癌干预的新的靶分子。 第三部分Src激酶在奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞增强的侵袭转移中的作用及其机制研究 一奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞侵袭转移能力的变化。 目的：模拟体内化疗后残存的肝癌细胞,建立奥沙利铂化疗诱导的肝癌细胞,以了解肝癌细胞化疗后出现的恶性特征及其机制。 方法：本研究使用时间逐步递增化疗药物浓度,间歇作用体外诱导法培养建立人肝癌奥沙利铂化疗诱导残癌细胞,通过体外实验了解细胞化疗后增殖,侵袭转移能力的改变；并使用western-blotting的方法检测p-Src、p-FAK、p-Stat3及E-cadherin、 Vimentin等的变化。使用奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞接种裸鼠皮下成瘤后,接种于肝脏,观察肝脏肿瘤大那个小及肺转移。 结果：奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞形态发生梭形样变、侵袭迁移能力增强；p-Src、 p-FAK、p-Stat3表达增高,E-cadherin表达降低,Vimentin表达增多。在裸鼠肝癌模型中,化疗诱导肝癌细胞肝脏原位瘤增殖增快、肺转移增加。 结论：奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞侵袭转移能力增强、肺转移增加。奥沙利铂化疗诱导肝癌细胞通过Src激酶及其下游磷酸化信号的激活诱导EMT发生,进而导致肿瘤侵袭转移能力增强。

用量子化学密度泛函理论B3LYP方法结合6-311G(d,p)基组和自洽反应场(SCRG)极化连续介质模型(PCM)对1,7-二氧杂螺[5.5]十一烷的异头效应进行了理论研究.结果表明,1,7-二氧杂螺[5.5]十一烷的3种异构体中,A表现为双异头效应,B表现为单异头效应,C没有明显的异头效应.在气相条件下,A和B的异头效应能分别为36.0和19.因为7kJ/mol.在水溶液中,A和B的异头效应能分别为26.4和14.0kJ/mol.溶剂的介电常数和偶极矩越大,A和B的异头效应能越大.恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重大难治性疾病,人类在恶性肿瘤的治疗过程中经历了漫长的历史变迁。Aurora激酶家族是苏氨酸/丝氨酸激酶,是细胞有丝分裂期重要的调节因子,可影响细胞周期进程,是抗肿Selleckchem AC220瘤药物的新靶点。本文简要对Aurora激酶的生物学功能、与肿瘤的关系及其抑制剂的研究进展进行综述。在有丝分裂的过程中,Aurora激酶参与纺锤体形成,中心体成熟,染色体分化和胞质分裂。Aurora激酶的过度表达或分化易导致有丝分裂异常,与形成肿瘤的基因组不稳定性密切相关。以Aurora激酶为靶点设计、合成的药物已成为近年来肿瘤或者药物治疗的研究热点。本文综述了已经进入临床研究的Aurora小分子抑制剂在临床前、临床的研究进展。~~蛋白激酶在细胞周期的各个阶段及细胞周期检测点发挥着重要的调控作用,而异常的细胞分裂往往是肿瘤发生的标志之一。多种有丝分裂激酶与肿瘤的发生密切相关,被检测在多种肿瘤细胞中过度表达,使其成为抗肿瘤药物研究的靶点。目前一些抗肿瘤药物的研究集中在有丝分裂激酶的抑制剂上,许多小分子抑制剂已经进入临床实验研究阶段。

这里我们同时用到了癌细胞系的基因组信息(基因表达)以及天然产物的化学结构特征(化学描述符)。当这些机器学习模型分别应用到两个数据集,训练集和独立的测试集时,这些预测模型展现出了非常好的预测准确性。此外,我们也证明了该方法对于两种天然产物,即姜黄素和白藜芦醇抗肿瘤活性的预测能力。这表明该方法能够有效地预测出这两种天然产物与多种癌症细胞系敏感性的一一对应的关系。一般同时把病人的基因组特征信息与天然产物的敏感性联系起来。基于以上结果,有理由认为该方法能够在癌症的预防治疗以及精确性医疗的发展中,对鉴定潜在的候选天然产物起到促进的作用。近年来,很多天然产物在实验室被分离纯化,并且被证明具有一定的抗肿瘤活性,例如喜树碱,长春花碱,信筒子醌,紫杉醇等等。这些天然来源的产物已在黑色素瘤,白血病,乳腺癌等多http://www.selleck.cn/products/blu9931.html种癌症的治疗当中起到关键的作用。另外,越来越多基于天然产物结构的新的衍生物成为了抗肿瘤的候选药物。然而,用实验的方法来筛天然产物先导化合物是极为费时费力的。因此,应用计算的方法对其构效关系的研究是一个好的选择。传统的研究构效关系的方法大都是拥有化学背景的科研人员以先导化合物的基本骨架为基础,合成一系列的类似物,再根据经验来对它们的抗Dabrafenib肿瘤活性进行预测。这些构效关系的研究方法只用结构信息,尝试对单个癌症细胞系或者单一组织类型的抑制进行预测。尽管已经取得了许多成果,该问题还远远没有被很好地解决。为了获得全面的分析,我们打算使用一种新的,同时基于化学结构和基因组信息的研究思路。这样可以一次同时检测多个己知的癌症细胞系对数百种天然产物的敏感性。我们首次使用癌细胞系的基因表达数据和天然产物结构的化学描述符建立了机器学习方法来预测癌细胞系对天然产物的反应。

单因素分析提示：ECOG评分与患者OS和PFS有相关性(p0.05)。但在多因素Cox回归分析中未能显示独立预后因素。研究中观察到的不良反应有：骨髓抑制、胃肠道反应、黏膜反应、乏力、脱发、药物性皮疹及轻度的肝肾功能异常,以1-2级不良反应为主。其中3级以上不良反应为：白细胞减少(32%)、中性粒细胞减少(42%)、血小板减少(5%)、呕吐(5%),经对症支持治疗Abiraterone数据表后可缓解。 结论：吉西他滨联合多西他赛方案治疗软组织肉瘤安全、有效。因本研究样本量少,需要进一步的大样本资料分析及相关的前瞻性研究验证。恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病,已取代心脑血管疾病成为全球头号杀手。目前临床上使用的抗肿瘤药物往往存在疗效较差、毒副作用大、易产生耐药性等缺点。因此,研究疗效更好、毒副作用更小的新型抗肿瘤药物是当还有前新药研究与开发领域的热点。细胞周期依赖性激酶(Cyclin dependent kinases)在调控细胞周期进程中处于核心地位,对肿瘤细胞中过度表达的CDKs进行抑制从而有效地遏制肿瘤细胞增殖,成为一种极具潜力的癌症治疗策略。本文以临床Ⅱ期的CDK抑制剂PHA848125为先导,保留其结构中与铰链区Leu83残基形成关键氢键作用的氨Bleomycin基嘧啶结构。应用开环策略和生物电子等排原理,分别用三氮唑和咪唑代替先导化合物中的吡唑,并在咪唑上引入不同烷基,与蛋白疏水性口袋相互作用,设计并合成了嘧啶-三氮唑类和嘧啶-咪唑类共33个全新结构的目标化合物,经1H NMR和MS分析确证。CDK2/CyclinA活性研究表明,5个化合物(A-5、A-11、B-12、B-15、B-19)表现出较显著的CDK2/CyclinA抑制活性,IC5o为0.22μM～1.42μM。

05);而损伤侧与细胞联合移植侧测得的波幅相比较没有明显差异,没有统计学意义(P＞0.05)。比较之,损伤侧损伤平面以上节段测得的潜伏期较损伤侧损伤平面以下节段测得波幅明显延长,有统计学差异(P＜0.05);而细胞联合移植测得的潜伏期较损伤侧测得的潜伏期明显缩短,有统计学差异(P＜0.05)。 6.4 MRI:脊髓左侧半横断+细胞移植瘢痕横切面积明显小于单纯脊髓左侧半横断组脊髓损伤对照节段面积,有统计学差异(P＜0.05);而脊髓损伤上1节段和损伤下1阶段脊髓横切面面积无明显差异,均没有统计学差异(P＞0.05)。 7.PDGF-B在大鼠脊髓全横断损伤后的变化和作用研究:SCT后1天直至损伤后28天,PDGF-B蛋白质和mRNA在损伤脊髓中明显上调。PDGF-B免疫反应的产物分布在疤痕星型胶质细胞中。同时星型胶质细胞明显增值,疤痕组织内的PDGF-B信号分子转录激活因子3(STAT-3)的上调相一致。通过PDGB-B抗体封闭和iRNA对PDGF-B活性分别在蛋白水平和基因水平进行阻断和干扰,导致以下几方面的显著改变:(1)显著下调了PDGF-B下游信号分子的水平;(2)显著减少了星形细胞胶质增生和疤痕的形成;(3)增加轴突再生和出芽;(4)后肢运动功能和感觉功能的显著改善。 一般 【结论】 1本实验通过不同的细胞组合治疗方法,在低等啮齿类动物SD大鼠和高等灵长类动物恒河猴SCI模型上证明了NSC联合OEC移植能够最有效促进损伤脊髓的运动功能恢复。是目前较为乐观的有效策略。移植细胞能够在大鼠和猴损伤脊髓长时间存活、迁徙。NSC联合OEC移植作为一种治疗SCI的有效方法,具有潜在的临床应用价值。 2 NSC联合OEC移植有效促进损伤脊髓的运动功能恢复与多种细胞因子的表达调节有关。其中PDGF-B是较重要的分子。 3 PDGF-B蛋白和基因干扰,能显著减少了星形胶质增生,抑制疤痕形成,促进轴突再生,并改善后肢运动功能。从而证明PDGF在SCI修复中是一个关键的调节分子。目的:探讨claudin-6(CLDN6)过表达对乳腺癌细胞MCF-7生物学表型的影响及相关的分子机制。 方法:用脂质体法将含有CLDN6的真核表达载体转染乳腺癌细胞系MCF-7后,采用RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光方法进行稳定克隆的筛选和鉴定;采用MTT法、克隆形成实验和流式细胞术检测细胞生长情况;采用TUNEL法、Annexin-V/PI双染法和DAPI染色法检测细胞凋亡情况;采用划痕法、Transwell小室法和粘附实验检测细胞迁移、侵袭和粘附性;通过跨上皮电阻检测估计紧密连接功能;建立小鼠肾被膜下移植侵袭模型检测体内侵袭能力;应用Western Selleckchem AC220 blot、TUNEL法、划痕法、Transwell小室法检测相关信号途径的变化对细胞凋亡、迁移和侵袭能力的影响。 结果:建立了稳定表达CLDN6基因的4株单克隆;CLDN6主要表达于细胞膜;过表达CLDN6的细胞生长缓慢、克隆形成能力降低;诱导细胞凋亡;细胞的迁移性和体内外侵袭性被抑制;细胞间紧密连接功能增强;过表达CLDN6上调磷酸化p38蛋白的表达,p38抑制剂逆转CLDN6对细胞凋亡和侵袭能力。 结论:CLDN6能够明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,抑制迁移和侵袭能力,增强紧密连接功能。CLDN6对MCF-7细胞生物学行为的影响可能与p38信号转导途径的激活有关。近年来糖尿病心肌病(DCM)逐渐受到重视,临床和动物实验已经证实其明确存在,认为它是与大血管及冠状动脉病变无关的心肌病变,与糖尿病患者高心力衰竭发病率和死亡率密切相关。临床研究表明,糖尿病心肌病通常以左心室肥厚和舒张功能减退为早期表现,Poirier等发现血糖控制良好、没有明显慢性并发症的2型糖尿病患者60%存在左室舒张功能缺陷。临床约有10%～30%的糖尿病患者发生心衰。DCM主要病理改变包括心肌细胞增生、肥大,细胞外基质(ECM)积聚、纤维化。DCM发病机制迄今尚未完全阐明,目前研究表明,促进心肌纤维化的炎性、细胞因子异常表达参与其发病,影响心肌细胞舒缩性和心肌间质重构。具体的情况及其分子机制仍不明确,有待深入研究。 Selleck CX 5461 目的: 建立STZ诱导糖尿病大鼠动物模型,观察糖尿病心肌组织中结缔组织生长因子(CTGF)表达异常对心肌间质纤维化、左室肥厚及心功能的影响;同时探讨缬沙坦、氟伐他汀及两药联合应用对糖尿病心肌病的保护作用及可能机制,为临床用药提供实验依据。 方法: 雄性SD大鼠尾静脉注射STZ致糖尿病模型,成模后随机分为:糖尿病模型组(DM)、缬沙坦组(30mg·kg~(-1)·d~(-1))、氟伐他汀组(4mg·kg~(-1)·d~(-1))、缬沙坦联合氟伐他汀组及正常对照组共5组,每组8只。干预治疗12周后采血测空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白。用导管法测定血流动力学参数:左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(+dp/dt max)和下降速率(-dp/dtmax)。血流动力学监测完毕后,从主动脉根部水平离断心脏,用冷生理盐水充分冲洗后,滤纸吸干,称重。计算心脏相对重量百分比(全心重/体重~*100%)。对各组进行HE、PAS、Van-Gieson染色。观察糖尿病大鼠心脏组织的病理改变。利用Van-Gieson染色,图像分析左室心肌胶原含量;半定量RT-PCR方法检测大鼠心肌组织结缔组织生长因子(CTGF)基因表达情况;应用Western blot技术检测心肌组织Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、转化生长因子-β1、CTGF蛋白表达的变化。 结果: 1、各组大鼠一般状况和体重、心/体比率及生化指标的变化:糖尿病SD大鼠表现为明显代谢紊乱,体重明显低于正常对照组,心/体比率明显增加37%(P＜0.01)。治疗后,缬沙坦组心/体比率下降10%,氟伐他汀组下降8%,联合治疗组效果更佳,下降13%(P＜0.01);糖尿病大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白(HbA1c)水平明显高于正常对照组,但各个治疗组无统计学差别。糖尿病组大鼠血TG、TC、LDL-C均较正常对照组明显升高(P＜0.01)。与糖尿病组比较,氟伐他汀组和联合治疗组TC、LDL-C均有下降,有显著性差异(P＜0.01)。 2、与正常对照组比较,DM组血流动力学指标LVSP、±dp/dt max均降低,LVEDP明显升高(p＜0.05);三个治疗组血流动力学指标较DM组均有改善(P＜0.05);联合治疗组LVSP、±dp/dt max明显升高,优于单药治疗组(P＜0.05)。 3、VG染色图像分析胶原纤维阳性面积测定的结果显示:糖尿病组大鼠心肌组织胶原纤维染成红色,心肌细胞间充满大量胶原纤维,分布散乱相互连成网状,血管周围聚集较多,与正常对照组相比,胶原纤维阳性面积明显增加,为正常对照组的2.1倍(P＜0.05)。两单药治疗组心肌组织胶原纤维面积均有所降低(P＜0.05),但仍高于正常对照组(P＜0.

49±0.45 μmol/L和25.4±1.1pmol/min/mg protein;NC在MDCK-hOCT1/MDCK-hOCT3细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC50值分别为0.163±0.027 μmol/L和0.522±0.072 μmol/L。而在mock细胞上IC50值为17.0 ±4.2 μmol/L。OCT1/3抑制剂(+)/(-)-THP均能显著降低NC的细胞毒性；经0.5μmol/L NC处理,MDCK-hOCT1和MDCK-hOCT3细胞存活率分别降低至空白对照组的17.5±4.7%和55.4±3.8%,50μmol/L的(+)/(-)-THP使MDCK-hOCT1细胞存活率分别升高至对照组的45.6±1.2%和51.6±2%,使MDCK-hOCT3细胞存活率升高至对照组的89.1±5.3%和86.1±7.0%。在大鼠原代肝细胞模型上也观察到(+)/(-)-THP对NC诱发的肝细胞毒性的减弱作用。NC在MDCK-hMATE1细胞上的积聚显著高于mock细胞,其Km、Vmax及Clint分别为0.897±0.085 因为 nmol/L,18.5±1.0 pmol/mg protein/min,为20.6mL/mg protein/min。然而,MATE1对NC的转运能力(Clint:20.6 mL/mg protein/min)明显低于OCT1(Clint：311 mL/mg protein/min)。结论：OCT1,OCT3通过介导NC的细胞摄取,在其致肝细胞毒性中发挥重要作用；(+)/(-)-THP通过抑制OCT1,OCT3介导的细胞摄取而减弱NC的肝细胞毒性。MATE1对NC的转运能力低于OCT1,推测肝细胞中由hOCT1和hOCT3介导的NC摄取大于hMATE1介导的外排。第三章CYP450对Nitidine的代谢解毒作用背景和目的：第二章实验结果显示,NC在大鼠原代肝细胞上的毒性明显低于稳定高表达OCTs的MDCK细胞上的毒性,我们推测原代肝细胞中OCTs表达可能低于稳定转染细胞,推测原代肝细胞中P450酶(CYP450)可能介导NC代谢,从而降低NC的细胞毒性。因此,本章研究CYP酶对NC的代谢及在其肝细胞毒性中的作用。方法：应用人肝微粒体代谢酶表征实验和人重组酶验证,阐明参与NC肝脏代谢的主要CYP酶亚型；比较NC对MDCK-hOCT1细胞及hOCT1与hCYP3A4双转细胞(MDCK-hOCT1/hCYP3A4)的毒性差异,以及CYP3A4抑制剂对NC致MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞毒性的影响,阐明CYP酶对NC的代谢解毒作用。结果：CYP3A4, Pifithrin-α半抑制浓度 CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的肝脏代谢。NC (0.25-10 μmol/L)对MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞的毒性明显低于对MDCK-hOCT1细胞的毒性；CYP3A4抑制剂,氟康唑和红霉素,显著增强NC在MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞上的毒性,提示CYP3A4通过介导NC代谢而减弱NC的毒性。结论：肝脏CYP3A4, CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的一相代谢；CYPs,如CYP3A4,可通过介导NC的肝脏代谢而降低其肝细胞毒性。第四章Nitidine在大鼠体内的药动学和组织分布研究背景和目的：前述研究考察NC在转基因细胞模型及原代肝细胞模型上的摄取及细胞毒性,本章主要考察单次口服和尾静脉注射后,NC在大鼠体内的药动学过程,并计算其口服生物利用度,以推测口服给予NC后在体内是否会引起毒性。同时考察单次及连续20天静脉注射NC (5mg/kg)后,其在大鼠体内的组织分布,以阐明NC分布的组织特异性及连续给药可能由OCTs介导NC细胞摄取发生的组织蓄积现象,为NC的体内毒性提供药动学依据。方法：建立快速、准确、灵敏的LC-MS/MS法测定生物样本中的NC,并将此方法用于测定大鼠口服10mg/kg或尾静脉注射2 mg/kgNC后的血浆药物浓度,计算其口服生物利用度；比较单次静脉注射5 mg/kg NC与相同剂量连续给药20天后相应组织的分布差异。结果：大鼠口服10 mg/kg NC后,血药浓度低,其绝对生物利用度仅为4.8%。鉴于口服NC的生物利用度低,本章考察了大鼠单次静脉注射5 mg/kg NC后的组织分布,结果显示,给药后0.25 h、0.5 h及2h,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度远远高于其在血浆中的浓度,组织与血浆的浓度比值为9.2-2852；以5mg/kg/day的剂量连续静注20天,末次给药后2h,心脏、肝脏、肾脏及小肠中NC的浓度均高于单次给药后相应组织中的浓度。结论：NC的口服生物利用度低,推测其口服后产生毒性的可能性较小。单次静脉注射NC后,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度高于其在血浆中的浓度。因此,推测大鼠连续静注NC,可能会产生组织蓄积而引起一定的毒性。第五章Nitidine连续给药后大鼠体内的毒性研究背景和目的：前几章研究显示,由于肝脏细胞中OCT1/3介导NC的细胞摄取,导致NC较强的肝细胞毒性。但NC经口给药后绝对生物利用度低,而静脉注射后组织分布研究表明,NC在不少组织中的浓度显著高于血浆中浓度,且连续给药后,在大鼠肝脏、肾脏及心脏等脏器存在蓄积现象,提示连续给药NC在大鼠体内可能引起脏器毒性或整体毒性。因此,本章考察大鼠连续静脉注射NC后的毒性,为NC的研发提供参考。方法：Sprague-Dawley大鼠连续20天静脉注射5 有 mg/kg/day NC,观察其一般活动行为、体重、检测血清生化指标,组织病理学检查,综合评价NC在体内的整体毒性。以MDCK-hOCT2和mock细胞为模型,采用MTT法及检测细胞培养液中LDH活性的方法,对hOCT2介导的NC细胞毒性以及OCT2抑制剂,(+)/(-)-THP和西咪替丁,对其细胞毒性的减弱作用进行考察。结果：NC可引起大鼠食欲减退,体重减轻,血清LDH值和BUN值明显升高,分别为给药前的2.1倍和1.4倍,ALP值显著降低至给药前的1/5,且组织病理学检查观察到肾小管产生空泡变性,未发现NC在大鼠体内对其它受检脏器引起毒性。此外,NC在MDCK-hOCT2细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC5o值分别为0.556±0.083 μmol/L及17.0 ±4.

01)，提示染铅组大鼠体内~(45)Ca~(2+)摄入远低于对照组。各组大鼠骨钙含量比较结果为：对照组＞高钙铅处理组＞铅处理组＞低钙铅处理组，而大鼠骨骼中铅含量结果则与之相反，雌雄均呈类似趋势。铅处理组和低钙铅处理组雄性大鼠骨铅水平相近，其余组间骨钙和骨铅差异显著(p＜0.05)，统计分析发现二者呈直线负相关。激光共聚焦扫描电镜观察Fluo-3／AM分子探针标记的成骨细胞内Ca~(2+)荧光时发现，胞内游离Ca~(2+)浓度在铅作用下升高。证实铅对体内外钙的吸收均有着显著的抑制作用。 为什么 5．大鼠血液OC值在对照组中最大，其次为高钙铅处理组，铅处理组列第三，均高于低钙铅处理组，组间差异明显。雌雄类似，但雄性中尤其明显。与之相反的是，大鼠血液PTH含量则表现为低钙铅处理组中最高，其次为铅处理组、高钙铅处理组和对照组。除雄性大鼠铅处理和高钙铅处理组外，其余大鼠各组间PTH含量差异极显著。统计分析结果显示，大鼠OC和PTH之间并不存在直线负相关；但作散点图分析发现，OC和PTH之间存在负相关的趋势。PTHr1在低钙铅处理组中高表达，而在对照组中低表达，高钙铅处理组表达量高于对照组但低于铅处理组。OC的表达趋势与PTHr1相反，对照组和高钙铅处理组中OC高表达，低钙铅处理组中表达量极少，铅处理组表达则稍多于低钙铅处理组。结果表明铅影响了大鼠体内骨相关蛋白及其受体的表达。 6．大鼠股骨OB及UMR106细胞电镜超微结构显示，铅使两类细胞结构不同程度改变，尤其是线粒体和粗面型内质网的结构变化较大，但对于细胞膜系统的损伤则仅在高浓度时出现。结果表明铅损伤了成骨细胞的结构。 7．铅使UMR106细胞贴壁性下降，OB的形态发生改变。OB和UMR106细胞ALP、CollagenⅠ随铅浓度的增加而表达减少，提示铅影响了成骨细胞的形态及标志物的表达；铅降低了成骨细胞OC的分泌，并使OC的调节因子如bFGF、cbfa1／osf2、c-fos和c-jun的表达减少；铅明显促进p-ERK1／2的表达，ERK1／2途径的特异性阻断剂PD98059可使铅对UMR106的这种作用减弱或消失，但对于总ERK1／2的表达并无影响。表明MAPK(ERK1／2)信号转导转导途径可能参与了铅对成骨细胞毒性作用的调控。 Lonafarnib体外 综上所述，铅抑制了骨骼的正常生长发育，低钙处理加剧了其作用，而适量的钙补充有利于减轻铅对于骨骼生长的抑制作用。铅对于骨骼生长发育的毒性与铅干扰机体钙的吸收和利用，以及与铅对OC表达的直接或间接影响相关，其中可能有ERK1／2信号转导途径的参与。原发性支气管肺癌(简称肺癌)，是最常见的肺部原发性恶性肿瘤。世界上至少有35个国家的男性肺癌在各种癌症死因中占第一位，女性中死于肺癌的患者也仅次于乳腺癌的死亡人数。研究表明组蛋白的乙酰化状态对参与细胞增殖和分化的基因表达具有重要调控作用，因此，基于组蛋白乙酰化的治疗策略逐渐引起重视。本文主要研究了组蛋白去乙酰基酶(histone deacetylases，HDAC)抑制剂(histone deacetylases inhibitor，HDACI)TSA(Trichostatin A)对肺腺癌细胞A549的生命活动包括细胞周期及凋亡的影响，并且对特异Ⅱ型肺细胞标志——muc1基因和细胞周期调节因子cdc2基因启动子区的染色质重塑机制以及转录相关因子的结合进行了研究，为非小细胞肺癌的临床治疗提供一定的理论依据。 一、TSA对肺腺癌细胞A549的细胞周期及凋亡的影响 1．TSA对肺腺癌细胞A549的细胞周期的影响 400nM TSA处理A549后，进行流式细胞仪检测结果显示：TSA可以引起A549细胞周期在G1期和G2／M期产生阻滞，以G2／M期阻滞更为显著。同时发现TSA也抑制G2／M期细胞周期相关因子cdc2，cdc25c以及cyclinB2的mRNA的表达，促进G1期细胞周期相关因子p21 mRNA的表达。 2．TSA对肺腺癌细胞A549凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示400nM TSA处理16小时起A549细胞开始出现凋亡，随着TSA处理时间的延长，凋亡程度逐渐加重；同时western blotting结果显示400nM TSA处理16小时起，PARP开始出现断裂，随着时间的延长PARP断裂程度逐渐加重。 二、TSA与p53对muc1基因及cdc2基因启动子活性的影响 1．TSA对muc1基因及cdc2基因启动子活性的影响：构建带有人2.4kb的muc1基因上游调控区序列以及cdc2基因启动子区的-758／+61的CAT报告基因质粒pREP4m-muc1-2.4k与pREP4m-cdc2-CAT。将含有报告基因表达质粒pREP4m-muc1-2.4k和pREP4m-cdc2-CAT以及内参照质粒pM-CAT瞬时共转染A549细胞之后加入TSA进行诱导处理，启动子活性分析结果表明：TSA可以抑制muc1和cdc2基因的启动子活性。将muc1基因上游调控区进行删切，构建不同长度(4k、1.6k、298bp、724bp)启动子序列驱动的报告基因质粒，启动子活性分析结果表明：TSA对muc1基因转录活性的抑制可能通过muc1基因启动子区-724上游的调控区介导。 寻找更多 2．p53对muc1基因及cdc2基因启动子活性的影响：p53表达质粒与pREP4m-muc1-2.4k和pREP4m-cdc2-CAT以及pM-CAT瞬时共转染A549细胞，启动子活性分析结果表明，p53可以降低muc1基因和cdc2的启动子活性，突变的p53表达质粒可以减弱这种抑制作用，TSA处理可以加强p53对muc1基因的抑制，同时western blotting结果显示TSA处理可以促进p53的表达，提示TSA可能通过p53间接调节muc1基因的表达。将muc1基因上游调控区的两个CCAAT盒以及一个潜在的p53半位点分别进行突变后与pM-CAT瞬时共转染A549细胞，启动子活性分析结果显示，潜在的p53半位点突变后p53抑制muc1基因启动子区活性的作用急剧减弱。这些结果提示，p53可能通过p53结合位点发挥对muc1基因的调节作用。 三、TSA对染色质重塑蛋白及修饰因子对muc1基因启动子活性的影响 1．PCAF与p300对muc1基因启动子活性的影响：PCAF表达质粒或p300表达质粒与pREP4m-muc1-2.4k和pM-CAT瞬时共转染A549细胞，启动子活性分析结果表明，PCAF和p300可以增强muc1基因启动子的活性。 2．BRG1与BRM对muc1基因启动子活性的影响：BRG1表达质粒(或其显性负突变体)与pREP4m-muc1-2.4k和pM-CAT瞬时共转染A549细胞后，启动子活性分析结果表明，BRG1表达质粒抑制muc1基因启动子的活性；BRM表达质粒(或其显性负突变体)与pREP4m-muc1-2.

体外原代培养的HUVECs，分为对照组和Notch信号阻断组，利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术，检测细胞内ROS水平。分别在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧（ROS）水平，并使用相关的抑制剂作用血管内皮细胞确定生理状况下，ROS的主要来源。 3.体外培养人原代HUVECs被分为六组：对照组（DMSO组），单纯Notch阻断组（GSI组），Notch阻断加NADPH氧化酶阻断组（GSI+DPI），Notch阻断加抗氧化剂组（GSI+NAC），单纯NADPH氧化酶阻断组(DPI)和单纯抗氧化剂组(NAC)。刺激后分别用MTT法检测细胞增殖；划痕法检测细胞迁移；结晶紫染色检测细胞黏附；细胞外基质胶（Matrigel）检测管腔形成。 4.体外原代培养的HUVECs，分为照组和Notch信号阻断组，经刺激48h，RIPA裂解收取蛋白，定量并变性后，蛋白印记法（Western-Blots）检测HUVECs相关蛋白表达水平变化。 【结果】 1．采用改良体外培养HUVECs培养方法，获得大量稳定血管内皮细胞，应用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基（ECM）培养细胞，MTT法观察细胞生长曲线表明：细胞生长旺盛2-3d生长最快，4-6d可融合。利用流式细胞技术进行APC-CD31细胞Marker以及免疫组织化学进行Ⅷ因子染色鉴定，血管内皮细胞的纯度高达99.56%。 Ipatasertib核磁共振 2.体外原代培养的HUVECs，经GSI阻断Notch信号后，利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术，结果表明：在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧（ROS）水平明显升高。随后使用相关的抑制剂作用血管内皮细胞后，利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术，结果发现：生理状况下，ROS的主要来源于细胞膜上的NADPH氧化酶。 3.体外培养的HUVECs，各组经刺激后分别用MTT法检测细胞增殖、划痕法检测细胞迁移、检测黏附及体外管腔形成。结果显示：阻断Notch信号通路后，HUVECs增殖明显增加；细胞迁移速度加快；黏附以及管腔生成增加；利用ROS清除剂以及NOX抑制剂后，细胞增殖明显减慢；划痕法检测细胞迁移；细胞迁移，黏附及管腔形成实验均得到相似结果。 4.体外原代培养的HUVECs经GSI阻断Notch信号48h后，蛋白印记法（Western-Blots）检测HUVECs相关蛋白结果显示：阻断Notch后，NOX4蛋白含量明显增加；VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加；SOD1蛋白水平未见明显变化。 【结论】 1．采用改良外培养HUVECs培养方法，获得大量稳定高纯度的HUVECs，为后续实验提供充足的细胞来源。 2.体外培养HUVECs，经GSI阻断Notch信号后，在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧（ROS）水平明显升高；使用相关的抑制剂后，证实血管内皮细胞内ROS的主要来源来细胞膜上的NADPH氧化酶。 3.体外培养HUVECs，经GSI阻断Notch信号及各组经刺激后， HUVECs细胞增殖、迁移、黏附及管腔生成明显增加；利用ROS清除剂以及NOX抑制剂后，细胞增殖明显减慢；划痕法检测细胞迁移；细胞迁移，黏附及管腔形成实验均得到相似结果，说明Notch信号时通过调细胞内ROS的水平来影响血管内皮细胞生物学行为。 此网站 4.体外原代培养的HUVECs经GSI阻断Notch信号48h后，Western-Blots结果显示：HUVECs经GSI阻断Notch信号后，ROS水平增加是NOX4蛋白激活引起其产生增多而非SOD1对其清除减少引起的；增加的ROS通过引起下游VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加而引起下游一系列信号反应。目的： 肝纤维化是多种慢性肝脏病变最终进展到肝硬化的一个重要中间过程，以肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化和细胞外基质（extracel lular matrix,ECM）的大量沉积为主要特征。研究证实，Wnt信号通路在肝纤维化的过程当中起到了重要的作用，其中以Wnt/β-catenin研究的最多。中药肝复康是我校病理生理教研室经多年实验总结出的抗肝纤维化的经验方，已证实对Wnt/β-catenin通路和非经典的Wnt/Ca2+信号通路均有抑制作用。目前，在对肿瘤一些的研究中发现，Wnt/Ca2+信号通路能够对Wnt/β-catenin通路起到抑制的作用，即说明了这两条通路在有些肿瘤中并不是单一的产生作用，而两条通路之间也是可能存在某种相互关系，能够相互影响，但在对肝纤维化的研究中则主要研究的是每条通路与肝纤维化的发生发展可能存在的某些机制，但对这两条通路之间的相互关系却还不十分明确。SB216763是GSK-3β的抑制剂，使胞浆中β-catenin大量累积并入核，从而激活Wnt/β-catenin通路。本实验通过使用中药肝复康药物血清和SB216763干预培养的HSC，然后分析在肝纤维化发生发展过程中Wnt/β-catenin通路与Wnt/Ca2+信号通路之间的相互关系。 获悉更多 方法： 用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5%CO2混合气体、37℃的孵箱中培养，传代大鼠HSC-T6细胞株。待细胞条件成熟后，再用不含血清的DMEM培养基饥饿培养24h后分组加药。 在六孔板中将细胞随机的分为以下五组：正常血清组（含10%正常大鼠血清的DMEM培养基）；SB21676320μM组(含10%正常大鼠血清，SB2167632umol/L的DMEM培养基）；SB21676310μM组（含10%正常大鼠血清，SB2167631umol/L的DMEM培养基）：肝复康治疗组（含10%肝复康治疗组大鼠血清的DMEM培养基）；SB21676320μM加肝复康治疗组（SB21676320μM基础上用10％肝复康药物血清干预），用孵箱在37℃，5%CO2混合气体的环境中培养48h。 逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)法检测HSC细胞中collagen I，collagen Ⅲ，a-SMA的表达和Wnt/Ca2+信号通路中的相关指标Wnt5a， Frizzled2，CAMKII， MPP-7mRNA相对表达量,免疫蛋白印迹法（western blot）检测细胞中MPP-7的蛋白表达量。实验结果均采用SPSS13.0统计软件分析。 结果： 1、SB216763与肝复康对大鼠HSC-T6细胞活性及a-SMA、I型、III型胶原的影响 1.1RT-PCR检测SB216763对大鼠HSC-T6细胞活性及a-SMA、I型、III型胶原的影响 SB21676310μM与SB21676320μM组HSC明显活化, I型胶原、…
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25%胰酶消化,以3000/孔接种于6孔板中,培养10天至两周。再进行HE染色检测细胞克隆存活。 7.siRNA沉默自噬关键基因Atg5和Atg7 取对数生长期耐药食管癌细胞EC109/CDDP,以1×105、孔接种于6孔板中,转染时细胞要达到90～95%的融合,培养24h,吸弃培养基,细胞换成在含血清和双抗的正常培养基中,每孔2ml培养基,放入培养箱中培养,等待转染。配制溶液A：每100μl培养基中含有150ng Atg5siRNA或Atg7siRNA,在溶液A中加入转染试剂12μ1/孔,加入的时候要小心滴入,并轻轻摇使溶液混合均匀,室温中放置10min。每孔100μl轻轻加入6孔板中,待6孔板都加完后,画十字的轻轻晃动平移6孔板使溶液混合均匀。放入培养箱中培养48h。48h后采用western blot方法检测Atg5或Atg7确定敲除效果。之后同样操作转染步骤,转染48h后加入顺铂2.5μM处理48h,用0.25%胰酶消化,以3000/孔接种于6孔板中,培养10天,再进行HE染色,观察克隆存活情况。8.流式细胞术检测顺铂对敏感细胞和耐药细胞凋亡的影响 取对数生长期EC109和EC109/CDDP细胞,以3×105/well接种于60mm培养皿中,培养24h,吸弃培养基,加入顺铂2.5μM处理细胞48h,撤去药物,分别1天,2天和4天后收集细胞,用不含EDTA Trypsin消化,2ml/well,消化时间要短,注意观察,一消化下来就马上用全培终止消化,收集在15ml离心管中,800rpm,5min;用PBS洗两遍,第一遍PBS的量2ml/Tube,800rpm,5min;第二遍PBS的量2ml/Tube,并转移至流式管,800rpm,5min;倒掉上清液,用滤纸倒靠滤干；配制1xBinging Buffer,以100μl/Tube加入流式管中悬浮细胞,加入PI2.5μl/Tube, GSK1120212小白鼠 FITC2.5μl/Tube;室温放置10min；最后以400μl/Tube加入1xBinging Buffer,流式机上样检测。 9.p-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性分析U0126对顺铂促衰老作用的影响 取对数生长期EC109和EC109/CDDP细胞,以1×105/well接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入顺铂2.5μM处理细胞48h,撤去药物,分别1天,2天和4天后吸弃培养基,每个孔用1ml PBS各洗两次,小心吸取防止细胞掉落,每个孔加入1.5ml1×Fixation Buffer室温中放置6-7分钟,在固定的这段时间内配制Staining Mixture,固定后每个孔用1ml PBS各洗三次后,加入新鲜配制好的Staining Mixture染液中,37℃孵育过夜,显微镜下观察细胞蓝染细胞数目。每种细胞计数四个视野,每个视野至少100个细胞,计算细胞染色阳性率。 为了研究联用U0126后对顺铂诱导食管癌细胞衰老的影响,取对数生长期EC109和EC109/CDDP细胞,以1×105/well接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入顺铂2.5μM, U0126和顺铂2.5gM联用U0126处理细胞48h,撤去药物,吸弃培养基,按上述步骤检测食管癌细胞衰老情况。 10.MAPKs和mTORC1通路活性的检测 药物处理细胞后,收集细胞并提取总蛋白。分别使用抗ERK1/2, phosphor-ERK1/2, p38, phosphor-p38, AZD2281分子重量 JNK, phosphor-JNK的单克隆抗体(cell signaling卫生),采用western blot的方法,检测蛋白的磷酸化来反应通路的激活或抑制。 mTORC1下游有两个关键的底物70kDa核糖体蛋白S6激酶(70kDa S6Kinase, S6K)和真核翻译起始因子4E(eIF4E)结合蛋白1(eukaryotic translational initiation factor4E-binding protein1,4E-BP1)。活化的mTORC1磷酸化激活S6K,磷酸化4E-BP1可以解除对eIF4E的抑制。这两者的磷酸化程度同mTORC1活性正相关。此外,mTOR在Ser2481位点上会自我磷酸化。当mTORC1活性增强时,该位点上的磷酸化也会增强。因此,我们可以通过检测S6K,4E-BP1和mTOR的磷酸化来显示mTORC1的活性。具体方法为：药物处理细胞后,收集细胞并提取总蛋白。采用western blot的方法,检测mTOR,phospho-mTOR(ser2481), S6K, phosphor-S6K,4E-BP1和phospho-4E-BP1的表达。…
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