Monthly Archive: January 2017

33(48h)和43 18μmol/L(72h),而对Aspc-1细胞的IC50达到19 65(48h)和13 32μmol/L

33(48h)和43.18μmol/L(72h),而对Aspc-1细胞的IC50达到19.65(48h)和13.32μmol/L (72h),均优于环巴胺;且对Aspc-1选择性更高。化合物16、17的抑制活性也优于环巴胺。初步构效关系表明,介芬胺的11位为亚甲基时活性最优,无论是羰基还是羟基取代活性均降低;藜芦胺的哌啶环接入大小合适的基团时会有助于活性提升。该结果为环巴胺类Hh通路抑制剂的结构优化提供了依据。目的结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。目前,外科切除联合化疗和/或放射治疗仍然是针对结肠癌的主要治疗方法,但是仍有很高的肿瘤复发率。虽然辅助放化疗能够在一定程度上延长患者的生存期,但同时也伴随着严重的副作用,因此急需发展更有效的治疗结肠癌的策略。近年来,临床前数据表明肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)起始了肿瘤的生长并且是肿瘤自我更新、分化、复发和转移以及放化疗耐受性的关键。根据肿瘤干细胞(CSC)理论,只有靶向清除CSC,才有可能治愈肿瘤。因此,本文以CD44为筛选标志,从小鼠结肠癌细胞系CT-26中分选出CD44+细胞作为小鼠结肠癌干细胞,探讨CD44+CT-26细胞裂解物和总RNA致敏的树突状细胞(dendritic 所以 cell,DC)是否能诱导靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤免疫应答。 方法用免疫磁珠法分离获得CD44+CT-26细胞,用含20ng/ml bFGF、20ng/mlEGF、2%B27的无血清DMEM/F12培养基培养扩增。将CD44+CT-26的细胞裂解物或总RNA分别作为抗原负载小鼠骨髓来源的DC,获得Pro-DC和RNA-DC疫苗,免疫接种有CD44+CT-26细胞的BALB/c小鼠,进行免疫保护实验和免疫治疗实验,每2-3天测量肿瘤大小并观察瘤体生长及小鼠存活情况。取小鼠的脾脏,体外检测T细胞的细胞毒性以及IFN-γ分泌能力。 结果(1)免疫保护组:与PBS组和未致敏DC组相比,Pro-DC组和RNA-DC组的成瘤时间延迟且肿瘤生长缓慢,尤其是Pro-DC组在接种后第15天仍未长出肿瘤。Pro-DC组和RNA-DC组的肿瘤重量显著低于对照组和未致敏DC组(P

通过亲和层析对细胞培养上清中的His6-IL-24重组蛋白进行纯化,超滤处理后HPLC测定的纯度为94 23%,ELISA测定的浓

通过亲和层析对细胞培养上清中的His6-IL-24重组蛋白进行纯化,超滤处理后HPLC测定的纯度为94.23%,ELISA测定的浓度为500ng/mL; 3.MTT实验显示:IL-24重组蛋白能够显著抑制IL-24受体表达阳性的黑色素瘤细胞A375和食管癌细胞Eca-109的体外增殖能力,在蛋白浓度为50ng/mL时细胞抑制率分别为34.69%和36.21%,而对同样表达IL-24R的正常人胚肺细胞HEL和1L-24受体表达阴性的肺癌细胞A549的增殖无影响;同样,IL-24重组蛋白能够显著抑制Eca-109和A375细胞的克隆形成能力,对A549和HEL没有影响,与MTT的结果相似; 4AnnexinV-FITC染色和流式细胞仪分析表明,IL-24重组蛋白能诱导A375和Eca-109细胞凋亡,重组蛋白终浓度为40ng/mL时,A375和Eca-109细胞凋亡率分别为64.5%和34.5%; 5.抗体中和实验提示,单独IL-24抗体(AF1965和MAB1965)、单独IL-24R抗体(IL-20R1,IL-20R2和IL-22R)和IL-24R抗体组合(IL-20RI+IL-20R2和IL-22R+IL-20R2)都能中和IL-24重组蛋白对A375细胞和Eca-109细胞增殖的抑制作用,提示分泌表达的IL-24重组蛋白可能是通过受体介导途径抑制IL-24R表达阳性的肿瘤细胞增殖; 6.IL-24重组蛋白(20ng/mL)处理A375和Eca-109细胞4h后,可使STAT3分子被磷酸化,处理1h时无作用。提示:分泌表达的IL-24重组蛋白能磷酸化STAT3分子,进而可能激活其下游分子最终诱导肿瘤细胞凋亡。 抑制肿瘤细胞生长是肿瘤生物治疗的重要目标,阐明抗瘤基因发挥生物学功能的作用形式和机制是肿瘤生物学基础研究的紧迫任务。本研究在建立稳定分泌表达IL-24重组蛋白工程细胞系的基础上,获得高纯度的IL-24重组蛋白,它不仅能够特异性抑制食管癌细胞Eca-109和黑色素瘤细胞A375的增殖和克隆形成能力,还能诱导细胞发生凋亡,IL-24重组蛋白可能是通过受体介导途径和激活SATA3分子发挥作用。本研究为将具有抗瘤活性的IL-24重组蛋白以蛋白药物形式应用于食管癌的临床治疗奠定了实验基础。癌症又称恶性肿瘤,是现代威胁人类健康和生命的主要杀手之一。随着医疗技术的发展,癌症患者的生存期限虽然有所延长,但癌症不能从根本上预防和治愈。一直以来广大学者都在开发新的抗癌药物,期待这类化合物不仅有很好的抗癌效果,又能最大程度的降低对机体的毒害,这是药物治疗癌症的理想模式。研究发现一些吲哚类化合物具有很好的抑癌活性[1,2],因此提取和合成此类化合物成为研究热点。 因为 和 很多癌细胞中周期抑制蛋白p53失活,部分原因是蛋白分子MDM2抑制了它的活性。MDM2与p53的相互作用已经被阐明[3],抑制机制非常明确,基于p53与MDM2作用部位的结构特点,近年来发现很多抑制MDM2-p53相互作用的小分子抑制剂,其中一种吲哚类化合物MI-219几乎能够完全模拟复合体p53-MDM2的四个关键残基,有亲和能力强,药效特征好等优点而被广泛使用[4]。因此胡文浩课题组在MI-219结构基础上合成了一系列新型吲哚类化合物。我们研究了这些化合物在几种癌细胞系上的毒性作用,并选择了两个活性较好的化合物A.001和N1424603,研究它们对Bel-7402人肝癌细胞凋亡的影响。 GSK1349572体内 1.新型吲哚类化合物抗癌活性的筛选 采用MTT法在五种癌细胞系上一共检测了17种化合物的诱导凋亡作用。结果筛选出多个具有较好抗癌活性的化合物,比如化合物A.001和N1424603,它们在一个或多个细胞系上有很好的活性,且这种作用有浓度依赖。接下来进一步研究化合物A.001和N1424603对人肝癌细胞Bel-7402毒性作用的机制。 2.化合物A.001、N1424603诱导Bel-7402人肝癌细胞凋亡的检测 我们采用Annexin V/PI双染法检测经化合物A.001和N1424603处理之后的Bel-7402细胞的凋亡率。实验结果表明两种化合物均能诱导细胞凋亡,而且诱导作用具有浓度依赖性,说明这两个化合物通过诱导细胞凋亡产生对细胞的毒性作用。 3.化合物A.001、N1424603对Bel-7402人肝癌细胞周期的影响 抑制细胞增殖的药物,除了通过诱导细胞凋亡之外,另一个重要机制就是阻滞细胞周期。因此我们采用PI单染法检测了Bel-7402细胞在化合物A.001和N1424603处理之后细胞周期的变化。结果表明,两种化合物均能诱导Bel-7402细胞周期发生变化。其中A.001在低浓度时主要将细胞阻滞在S期,高浓度时在G1期;对于N1424603,随着浓度上升,G2期细胞增多,S期细胞先减少后增加,在高浓度时G1期细胞减少。结果说明这两个化合物可以通过影响细胞周期抑制肿瘤细胞增殖。 4.化合物A.001、N1424603对细胞中细胞周期抑制蛋白的影响 已证明p21、p27和p53都能引起细胞周期阻滞,因此我们采用western blot方法检测化合物A.001和N1424603对它们表达的影响。研究显示,随着浓度的上升,A.001能上调p21和p27的表达,且均具有浓度依赖性,但是对p53和其活性形式p-p53的表达都没有影响;N1424603能上调p21的表达,下调p27的表达,对p53和p-p53的表达同样没有影响。 5.化合物A.001、N1424603对MAPK信号通路的影响 MAPK信号通路在影响细胞的增殖和凋亡方面起重要作用,因此我们研究化合物A.001和N1424603对其的影响。结果表明,A.

99%和42 16%。 结论:反复扩增HEK293细胞可得到高滴度AdEasyGFP和AdEasyBMP9,AdEasyGFP和A

99%和42.16%。 结论:反复扩增HEK293细胞可得到高滴度AdEasyGFP和AdEasyBMP9,AdEasyGFP和AdEasyBMP9诱导C3H10T1/2细胞后可使其高表达GFP和BMP9。 第二部分ERK1/2和P38MAPK通路在BMP9诱导C3H10T1/2细胞分化过程中的激活 目的:研究ERK1/2和P38MAPK通路在BMP9诱导C3H10T1/2细胞分化过程中的激活。 方法:免疫印迹检测经pAdEasyBMP9诱导24小时的C3H10T1/2细胞phospho-ERK1/2和ERK1/2、phospho-P38MAPK和P38MAPK的表达,免疫荧光定位phospho-ERK1/2、phospho-P38MAPK。 结果: 1.pAdEasyBMP9促进phospho-ERK1/2、phospho-P38MAPK的表达增高,却不影响ERK1/2、P38MAPK的表达水平; 2.经pAdEasyBMP9诱导前的C3H10T1/2细胞和经pAdEasyGFP诱导的C3H10T1/2细胞,phospho-ERK1/2和phospho-P38MAPK弥散分布于整个细胞内;pAdEasyBMP9诱导C3H10T1/2细胞24小时,phospho-ERK1/2有从胞浆到胞核移动、表达于胞核的不同状态;phospho-P38MAPK有表达于胞浆和胞核、仅表达于胞核的不同状态。 5FU 结论:pAdEasyBMP9诱导C3H10T1/2细胞分化过程中能够激活ERK1/2和P38MAPK通路。 第三部分ERK1/2和P~(38)MAPK通路在BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化过程中的作用 目的:研究ERK1/2和P~(38)MAPK通路在BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化过程中的作用。 方法:U0126和SB203580分别阻断C3H10T1/2细胞ERK1/2和P38MAPK通路,pAdEasyBMP9诱导21天时免疫印迹检测心肌特异性蛋白CX43,cTnT的表达,免疫荧光检测心肌特异性蛋白cTnT、-MHC的表达,Q-RT-PCR检测心肌特异性基因GATA4,MEF2C的表达。 结果:U0126和SB203580可显著性地抑制由pAdEasyBMP9诱导的C3H10T1/2细胞CX43、cTnT、-MHC、GATA4、MEF2C的表达。 结论:pAdEasyBMP9能通过ERK1/2和P~(38)MAPK通路诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化。目的:探讨糖基化终产物(AGEs)致糖尿病肾病(DN)系膜细胞外基质积聚的可能机制。 方法:体外培养人肾小球系膜细胞(HMCs),分别用不同浓度的AGEs作用相同时间或相同浓度的AGEs作用不同时间, MTT法测定各组系膜细胞的增殖情况;采用RT-PCR法和Western blot分别检测MMP-9、TIMP-1mRNA和蛋白的表达,同时观察AGEs作用下细胞膜上RAGE的表达以及p38MAPK磷酸化水平表达的变化;加入不同浓度的中和性抗RAGE抗体及p38MAPK特异性抑制剂SB203580预处理系膜细胞后,Western blot法观察MMP-9和TIMP-1蛋白表达的变化。 那个 结果:(1)浓度100~400μg/ml的AGEs作用系膜细胞24h或浓度200μg/ml的AGEs作用系膜细胞12~48h后,系膜细胞出现增殖,且随着AGEs浓度的升高、作用时间的延长,细胞增殖愈加明显。(2) AGEs能够促进HMCs RAGE的表达及p38MAPK的磷酸化,并以时间和剂量依赖方式诱导HMCs MMP-9的表达下调和TIMP-1的表达上调,各AGEs处理组与空白对照组比较有统计学差异,AGEs各组间差异亦有统计学意义(P﹤0.05)。(3)不同浓度的抗RAGE抗体和SB203580预处理后,与AGEs组比较,MMP-9的表达上升,TIMP-1表达下降,作用呈浓度依赖性。 结论:(1)一定浓度和时间范围内,AGEs促进人肾小球系膜细胞增殖。(2)AGEs以浓度和时间依赖方式诱导系膜细胞MMP-9表达的下调和TIMP-1表达的上调。(3)封闭细胞膜表面的RAGE受体或阻断p38MAPK通路可部分逆转AGEs引起的MMP-9、TIMP-1表达失衡,或可延缓糖尿病肾病的发生发展。目的:研究油酸对小鼠c2c12细胞PGC-1α 无 mRNA和蛋白表达的影响,并初步探讨p38MAPK信号通路在其中的作用,进一步阐明肥胖诱导的胰岛素抵抗发病机制。 方法:以体外培养小鼠c2c12细胞为对象,研究油酸对小鼠c2c12细胞PGC-1α表达的影响及其机制。①不同浓度油酸(0.1、0.2、0.5、1.0mmol/L)分别处理细胞6小时和12小时,采用RT-PCR检测PGC-1α mRNA的表达。②不同浓度油酸(0.1、0.2、0.5、1.0mmol/L)处理小鼠c2c12细胞12小时,分别采用相差倒置显微镜观察各组细胞形态变化及流式细胞术检测各组凋亡率。③用0.1、0.2mmol/L油酸处理小鼠c2c12细胞30分钟,采用Western Blot检测细胞p38MAPK磷酸化的表达。④0.2mmol/L油酸及20μmol/L p38MAPK抑制剂SB203580共同处理小鼠c2c12细胞12小时,采用RT-PCR和Western Blot检测PGC-1αmRNA和蛋白表达的影响。⑤分别用野生型、点突变型PGC-1α/PGL3融合载体转染小鼠c2c12细胞6小时,采用荧光素酶法检测PGC-1α启动子活性;用0.2mmol/L油酸及20μmol/L p38MAPK抑制剂SB203580共同处理转染后的小鼠c2c12细胞12小时,采用荧光素酶法检测PGC-1α启动子活性。 结果:1、以不同浓度油酸处理小鼠c2c12细胞6小时后,各处理组PGC-1α mRNA表达均无明显变化;不同浓度油酸处理小鼠c2c12细胞12小时后,0.2mmol/L油酸组PGC-1α mRNA表达明显高于对照组,而1.0mmol/L油酸组PGC-1α mRNA表达较对照组显著降低。 2、不同浓度油酸处理小鼠c2c12细胞12小时后,0.5mmol/L和1.0mmol/L油酸组与对照组、0.1mmol/L及0.

以缺陷性腺病毒(Ad-GFP)为载体介导HGF基因转染血管内皮祖细胞并计算转染效率 3 建立裸鼠缺血后肢模型后,将裸鼠分为3组,分

以缺陷性腺病毒(Ad-GFP)为载体介导HGF基因转染血管内皮祖细胞并计算转染效率 3.建立裸鼠缺血后肢模型后,将裸鼠分为3组,分别为空白对照组、EPCs组、HGF病毒转染EPCs组(Ad-HGF-EPCs),损伤后即刻及24h后分别将生理盐水、内皮祖细胞、携带HGF基因的EPCs以2×108cells细胞数由尾静脉注入裸鼠尾静脉。控制各鼠都输入同样生理盐水。观察期缺血肢体表现,ELISA检测血清HGF表达水平,激光多普勒(LDPI)检测血流灌注,CD31免疫组化检测毛细血管密度。 结果 1.成功分离和培养出大鼠骨髓血管内皮祖细胞,EPCs摄取Dil-acLDL、结合FITC-UEA-1双荧光细胞阳性率为(88.0±5.0)%。 2.成功将HGF基因转染大鼠骨髓血管内皮祖细胞,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,转染72h后,转染效率高达80%以上。 BVD-523 3.实验中成功建立缺血后肢模型。术后2天,三组裸鼠缺血后肢功能评分迅速升至高峰,证实建模成功。HGF基因转染EPCs移植后,肢体自截率及坏死率明显降低,缺血后肢功能评分明显较EPCs组低,证实移植后有利于肢体存活和功能恢复。而且ELISA证实Ad-HGF-EPCs移植后体内HGF蛋白持续高表达,术后2天后即达峰值,此后逐渐降低,但仍高于未转染EPCs移植及空白对照,并至少持续21天。激光多普勒及CD31免疫组化检测发现HGF基因转染EPCs移植后,缺血后肢血流灌注量和血管密度显著增加,作用远强于EPCs单独移植。 结论 腺病毒介导的HGF基因转染血管内皮祖细胞移植缺血后肢裸鼠后,可在体内持续过表达HGF蛋白,促进缺血后肢的血管生成,增加血管密度和血流量,改善后肢循环,有利于肢体存活和功能恢复。目的 蛋白酶活化受体4(protease-activated receptor,PAR4),是蛋白酶活化受体家族成员之一,属于G蛋白偶联受体。研究发现PAR4在正常和炎症条件下参与调节疼痛反应,目前PAR4在痛觉调节中的作用机制尚不清楚,可能是经过细胞内的信号转导机制作用于周围感觉神经元,其中部分可能是通过致敏瞬时受体电位香草酸亚型1(Transient 也许 receptor potential vanilloid1TRPV1)参与外周伤害性刺激的调节。为了进一步了解PAR4在背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)初级感觉神经元的表达,及与伤害性感觉受体TRPV1的共存,探究PAR4在外周伤害性感觉信号传导中的作用提供形态学依据。 方法 1.应用免疫荧光组织化学双标法结合激光共聚焦显微镜技术,观察PAR4在大鼠和小鼠DRG初级感觉神经元的表达及与TRPV1的共存。 2.腹腔内注射醋酸建立内脏疼痛大鼠动物模型,应用免疫荧光组织化学双标法结合激光共聚焦显微镜技术,观察PAR4在DRG初级感觉神经元的表达变化。结果 1. PAR4在小鼠DRG初级感觉神经元的表达及与TRPV1的共存:免疫荧光显示小鼠DRG内见有大量的感觉神经元表达PAR4,其形态多为中、小型的圆形、卵圆形,以及少量的大型神经元,可见少部分阳性神经元纤维。有80.5%±3.1%(3672/4558)神经元表达PAR4。免疫荧光双标法显示DRG内可见较多的TRPV1阳性神经元,均为中、小型感觉神经元胞体,许多DRG的PAR4阳性神经元的表达均与TRPV1的共存,有76.9%±3.4%(2826/3672)的PAR4阳性神经元表达TRPV1,有77.4%±3.1%(2826/3647)的TRPV1阳性神经元表达PAR4。 2. PAR4在大鼠DRG初级感觉神经元的表达及与TRPV1的共存:PAR4在大鼠的DRG内的表达与小鼠类似,同样见有大量的感觉神经元表达PAR4,其形态多为中小型的圆形、卵圆形,以及少量的大型神经元,细胞计数显示:有85.4%±4.1%(4337/5078)神经元表达PAR4。免疫荧光双标法显示有83.5%±3.6%(3623/4337)的PAR4阳性神经元表达TRPV1,有88.3%±3.5%(3623/4102)的TRPV1阳性神经元表达PAR4。 3.PAR4与CGRP在大鼠DRG初级感觉神经元的共存:免疫荧光显示大鼠DRG内见有大量的感觉神经元呈CGRP阳性,其形态多为中、小型的圆形、卵圆形,以及少量的大型神经元,并观察到部分CGRP阳性神经纤维,有75.6%±4.1%(3387/4478)阳性神经元表达CGRP。免疫荧光双标法显示有82.3%±4.6%(2788/3387)PAR4阳性神经元表达CGRP,有64.2%±3.7%(2788/4337)CGRP阳性细胞均表达PAR4。 查看更多 4. TRPV1与CGRP在大鼠DRG初级感觉神经元的共存:DRG内TRPV1阳性神经元与CGRP阳性细胞类似,均为中、小型感觉神经元胞体和一些弥散神经纤维。免疫荧光双标显示TRPV1/CGRP在DRG感觉神经元内广泛的共存,有83.9%±3.6%(2842/3387)CGRP阳性细胞均表达TRPV1,有69.2%±3.2%(2842/4102)TRPV1阳性细胞表达CGRP,也可观察到少量的TRPV1单标神经元或CGRP单标神经元。 5. PAR4在内脏疼痛大鼠动物模型中DRG感觉神经元的表达变化,在内脏疼痛大鼠动物模型DRG内PAR4阳性感觉神经元的数量明显增加,细胞计数显示PAR4阳性感觉神经元的数量与正常大鼠相比,增长了11.1%±2.3%,有96.5%±4.3%(5336/5528)神经元表达PAR4。同时DRG内TRPV1阳性神经元的数量也明显增加,有95.0%±4.4%(5110/5378)神经元表达TRPV1。免疫荧光双标显示有较多的PAR4/TRPV1双标细胞,分别占PAR4阳性和TRPV1阳性细胞的88.8%±3.7%(4742/5336)和92.7%±3.4%(4742/5110)。实验结果显示在大鼠DRG内见有许多感觉神经元表达PAR4,并与TRPV1广泛的共存。结论 1.PAR4在大鼠和小鼠的DRG初级感觉神经元有广泛的表达,主要为中、小型神经元。 2.PAR4与TRPV1在DRG初级感觉神经元存在广泛的共存,说明PAR4参与外周伤害性刺激可能与TRPV1的功能调节有关。 3.

7和腹腔巨噬细胞,观察在不同氧浓度状态下p38 MAPK的活性和TNF-α分泌水平的改变,同时应用p38抑制剂SB203580进行

7和腹腔巨噬细胞,观察在不同氧浓度状态下p38 MAPK的活性和TNF-α分泌水平的改变,同时应用p38抑制剂SB203580进行干预,证实低氧在TNF-α合成中的重要地位。在内毒素血症小鼠模型应用p38抑制剂SB203580治疗,观察小鼠血清TNF-α水平和肺组织HIF-1α蛋白的表达,阐明低氧和HIF-1α在调节脓毒症TNF-α产生的作用机制及其与p38 更多 MAPK通路的关系。 研究方法 1.SB203580对小鼠巨噬细胞系TNF-α产生的抑制效应与低氧和p38 MAPK活性的关系 (1)正常氧状态下SB203580抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞TNF-α产生的剂量关系实验 RAW264.7细胞分别用25μM和10μM SB203580预处理2 h,然后加入LPS10、100及1000 ng/ml,另外一组RAW264.7细胞分别用1-20μM SB203580预处理2h,然后加入LPS 1ng/ml或者用0.2-2μM SB203580预处理2 h,然后加入LPS 0.1ng/ml,正常氧状态下细胞继续孵育18 h,收集上清液。 (2)SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-α产生的抑制效应实验 RAW264.7细胞培养液加入10μM SB203580培养2 h后加入LPS 1 ng/ml,细胞分别在正常氧、低氧(0.5%O_2)和氯化钴(100μM)模拟低氧环境孵育18 h,收集上清液。 (3)SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-αmRNA转录活性及mRNA稳定性的影响实验 RAW264.7细胞处理同上,加入LPS培养2 EPZ-6438 价格 h后,用Trizol方法提取细胞RNA。 另设实验组在加入LPS 2 h后再加入2μg/ml转录抑制剂Actinomycin D,加入Actinomycin D的时间点为0时,在10、30和60 min时间点用Trizol收集细胞RNA。 (4)正常和低氧浓度环境下SB203580抑制效应的动态监测实验 RAW264.7细胞用10μM SB203580预处理2 h,在正常氧和氯化钴(100μM)模拟低氧环境下向细胞培养液中加入LPS…
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05);与R组相比,术前30mmin鞘内注射SB216763溶液可在术后2h、6h、24h使大鼠脊髓背角pGSK-3β水平增加,在

05);与R组相比,术前30mmin鞘内注射SB216763溶液可在术后2h、6h、24h使大鼠脊髓背角pGSK-3β水平增加,在术后2h、6h使NR2B表达减少,在术后2h、6h、48h使PP1表达增加,差异有统计学意义(P目的分离培养发育期根端复合体(developing apical complex DAC)并收集上清,制备不同条件培养基用于培养脂肪干细胞,检测发育期根端复合体细胞上清液对脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells ADSCs)增殖及分化的影响;研究不同浓度经典Wnt信号激活剂氯化锂(lithium chloride,Licl)对ADSCs增殖分化的影响,探索促进ADSCs增殖分化的最佳Licl浓度。 方法利用组织块结合酶消化法培养出生后20天(postnatal20days PN20d)的SD大鼠下颌磨牙DAC,并运用形态学、组织学及免疫组化染色方法鉴定DAC组织,收集原代DAC细胞的上清通过过滤及不过滤的方法分别制备成不同的条件培养基(DACCM-滤和DACCM-未滤);MTT检测不同培养条件培养基对ADSCs增殖活性的影响;碱性磷酸酶活性检测及RT-PCR检测不同培养条件基对碱性磷酸酶(alkaline 还有 phosphatase ALP)蛋白活性及基因表达的影响。以不同浓度Licl(0mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM、40mM)处理DACCM-未滤培养的ADSCs,MTT检测不同浓度Licl对ADSCs增殖能力的影响;ALP活性检测及RT-PCR检测ALP活性及ALP、BSP基因表达的影响。 结果本实验成功分离培养了发育期根端组织复合体,HE染色指出发育期根端组织复合体取自牙根尚未发育完全的大鼠;细胞形态学观察发育期根端组织复合体细胞为长梭形间充质来源细胞和多角形的上皮来源的细胞混合组成;发育期根端组织复合体细胞免疫组化染色结果CK-14,vimentin阳性表达;发育期根端组织复合体上清分别经过滤和未过滤的方法制备了不同条件培养基;MTT分析结果表明发育期根端复合体细胞条件培养基-未滤(DACCM-未滤)培养的脂肪干细胞增殖活性明显高于普通培养基和发育期根端复合体细胞条件培养基-过滤(DACCM-滤)(P

通过缺氧6h/复氧6h处理能够成功建立离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型。 2 不同浓度的PNU282987后处理均可抑制离体心肌细胞

通过缺氧6h/复氧6h处理能够成功建立离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型。 2.不同浓度的PNU282987后处理均可抑制离体心肌细胞缺氧-复氧损伤过程中的炎症反应,并产生明显的心肌保护作用。PNU282987后处理的炎症反应抑制作用存在有剂量-效应关系,但是其心肌保护作用存在“封顶效应”,在30μM时达到最强。 3.PNU282987后处理和TDZD-8后处理均能通过抑制缺氧-复氧心肌细胞GSK-3β活性而显著降低炎症反应和mPTP开放程度,并产生明显的心肌保护效应。并且TDZD-8后处理的心肌保护作用强于PNU282987后处理。 4.mPTP开放状态能显著影响缺氧-复氧心肌细胞损伤的程度,并主动参与炎症反应。表现为mPTP开放抑制剂CSA能显著降低心肌细胞缺氧-复氧过程中的炎症反应,维持心肌细胞线粒体膜电位,产生明显的心肌保护作用;而mPTP开放剂ATR则能显著上调此过程中的炎症反应水平,降低心肌细胞线粒体膜电位,显著加重缺氧-复氧心肌细胞的损伤程度。 5.mPTP过度开放能显著拮抗PNU282987后处理的心肌保护作用及其下调炎症细胞因子IL-6和TNF-a释放的作用。同时,PNU282987后处理亦能显著拮抗mPTP开放剂ATR后处理加重心肌细胞损伤及其上调IL-6和TNF-a释放的作用。 Selleckchem GSK1120212 6.除了抑制mPTP开放介导的细胞凋亡途径之外,PNU282987后处理还存在其它的抗细胞凋亡途径。第一部分GSK-3β在戊四氮慢性点燃大鼠海马表达与活性的动态变化 目的:在戊四氮慢性点燃大鼠过程中动态观察GSK-3β, P-GSK-3β(ser9), P-tau(ser396)蛋白在海马的表达变化,探讨GSK-3β在苔藓纤维出芽过程中的作用。 方法:6-8周健康雄性SD大鼠,共135只,将大鼠随机分为实验组(n=90)和对照组(n=45)。实验组予以每日腹腔注射戊四氮亚惊厥剂量(30mg/kg)建立慢性点燃颞叶癫痫模型,对照组每日予以腹腔注射等量的生理盐水。根据首次腹腔注射后第3天,1周,2周,4周和6周将实验组和对照组随机分为5个亚组。每个亚组再分为三个小组,实验组每小组6只大鼠,对照组每小组3只大鼠,分别进行:(1) Timm染色观察海马苔藓纤维出芽并评分;(2) Western blot方法检测GSK-3β,及其非活性形式P-GSK-3p (ser9)和下游磷酸化底物P-tau 点击此处 (ser396)三个指标在海马的总蛋白量的表达变化。(3)免疫组化方法分别检测GSK-3β、P-GSK-3β(ser9)、P-tau (ser396)在海马各区域的表达及分布变化。 结果: 1.实验组大鼠模型点燃成功率为94.7%,死亡率2.1%,所有达到完全点燃标准的大鼠均可见到反复自发痫性发作。对照组大鼠行为正常,始终未见痫性发作。 2.对照组大鼠CA3区在各时间点均未见明显出芽,实验组大鼠CA3区在点燃过程的第3天即观察到少量苔藓纤维出芽,并呈进行性增加。与对照组相应时间点比较差异有统计学意义(P0.05),其余各时间点之间比较均有差异(P0.05)。 3. Western blot结果显示:在戊四氮慢性点燃大鼠过程中,GSK-3β表达成升高趋势,2周时达高峰,6周时恢复至正常水平。其非活性形式P-GSK-3β www.selleck.cn/products/gsk-j4-hcl.html (ser9)表达变化与之相反,两周时表达下调至低峰,6周时恢复至正常水平。除6周组外,实验组各时间点与对照组相比具有差异(P0.05),其余各时间点之间比较均有差异(P