预浸在10% NO3 Ag 中

细胞按每孔50k 到100k的密度接种在6孔板中,24小时后,孔中加入20 μM PluriSIn #1 或 0.2% DMSO-对照。在37°C下含 5% CO2的环境中温育12小时后,移除旧的培养基,使用PBS洗涤细胞,加入包含 2.3 μM 0.75 UCi [1-14C] 硬脂酸的新培养基。细胞在37°C下含 5% CO2的环境下温育达4小时。温育结束后 ,除去培养基,使用2 mL PBS洗涤细胞三次。加入2 mL正己烷:异丙醇(3:2 v:v)的混合物,细胞在37°C下含 5% CO2的环境中温育30分钟。随后加入2 mL Folch溶液(氯仿:甲醇,2:1,v:v)。液体转移到试管中,加入1 mL水进行两相分配。较低的有机相蒸发,用于脂质皂化,游离的[1-14C] 硬脂酸(底物) 和 [1-14C]油酸(形成的产物进行)TLC分离。从细胞中提取的脂类加到TLC板上,预浸在10% NO3 Ag 中,在120°C下60分钟时激活。加入未标记的硬脂酸和油酸到各种的上样点,作为载体。作为内部识别标准。实验板使用氯仿:MeOH:AcH:DDW (90:8:1:0.8)的溶剂混合物进行跑胶。在TLC板上喷洒2′,7′-二氯荧光素溶液,通过U.V.检测游离脂肪酸。刮下硬脂酸和油酸相对应的斑点,使用闪烁计数器计算放射性。根据底物向产物的转化百分率和转换成pmol/min/106细胞,计算SCD1脱氢酶活性。

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