DNA复制压力诱发含有大量DNA双链断裂损伤的新型MN-γ-H2AX(+)

为了明确MN-γ-H2AX(+)这类新型微核发生的普遍性,我们对多种哺乳动物细胞进行免疫荧光实验,并选择了人类乳腺癌细胞系MCF-7进行进一步的研究。通过使用药物阻止DNA复制或使用具有DNA复制遗传缺陷的细胞进行实验,我们分析了DNA复制压力与这类新型微核形成的关系。实验结果如下:
1.通过对多种哺乳动物细胞进行免疫荧光实验和微核计数,结果发现:
1)微核分为MN-γ-H2AX(+)和MN-γ-H2AX(-)。4-Methylumbelliferone,MN-γ-H2AX(+)的特征为:微核中显示出均匀弥散的γ-H2AX染色,并且这种弥散性的γ-H2AX染色几乎占据了整个微核。
2)MN-γ-H2AX(+)的存在具有普遍性。不同细胞中MN-γ-H2AX(+)的发生频率有所不同,大约在0.5%到4%之间,占总微核的比例数在20%-50%之间。
2.使用药物处理MCF-7细胞,统计MN-γ-H2AX(+)的发生频率,结果如下:1)使用流式细胞术检测细胞周期分布情况。结果显示,未经药物处理组的S期细胞比例数为30%左右,而羟基脲、胸苷嘧啶、阿非迪霉素处理组的S期细胞比例数增至60%左右,说明药物处理使细胞停滞于S期。
2)使用导致S期停滞的药物羟基脲、阿非迪霉素、胸苷嘧啶处理MCF-7细胞,TAK-875,微核计数结果显示MN-γ-H2AX(+)发生频率的增加幅度远大于MN-γ-H2AX(-)发生频率的增加幅度。
3)紫杉醇通过抑制微管解聚使细胞停滞于有丝分裂中期,使用紫杉醇处理MCF-7细胞,产生的主要是MN-γ-H2AX(-),而MN-γ-H2AX(+)的发生频率并没有明显改变。
3.使用不同药物(阿非迪霉素、羟基脲、胸苷嘧啶、紫杉醇)处理MCF-7细胞24h后,更换为新鲜完全培养基释放不同时间(0h,6h,24h,48h,72h,96h),微核计数结果显示:
1)药物处理后未经释放的细胞中,MN-γ-H2AX(+)的发生频率已有明显增高;药物处理后分别进行6h.24h.48h.72h释放的细胞中,MN-γ-H2AX(+)的发生频率均高于未经药物处理的对照组细胞;药物处理后进行96h释放的细胞中,MN-γ-H2AX(+)的发生频率几乎恢复到本底水平。
2)根据药物处理后,细胞核中γ-H2AX染色的情况将细胞分为三类:对于整个细胞核均呈现出均匀弥散性γ-H2AX染色的细胞,我们将其定义为一类细胞;对于细胞核中存在大量γ-H2AX焦点的细胞,我们将其定义为二类细胞;APO866,对于细胞核中几乎没有γ-H2AX信号的细胞,我们将其定义为三类细胞。结合各类细胞占总细胞的比例以及细胞周期结果推测,药物处理后所检测到的一类细胞与二类细胞很有可能是处于S期且经历DNA复制压力的细胞。药物处理后对不同释放时间各类细胞产生的微核数进行统计,结果发现,使用阻止DNA复制的药物处理后,未经释放的情况下,大多数新产生的MN-γ-H2AX(+)都是由处于S期的一类细胞与二类细胞产生的。由此明确了MN-γ-H2AX(+)是在S期形成的。
4.免疫荧光实验观察小鼠皮肤成纤维细胞(MSF)发现有γ-H2AX信号在细胞核外周聚集成簇并且有向外突出的趋势,推测这样的细胞核突出部位很可能是MN-γ-H2AX(+)的前体。
5.使用具有DNA复制遗传缺陷的细胞进行实验,结果发现:
1)通过流式细胞术和BrdU掺入实验证明,在RPA1低表达的MCF-7细胞中存在DNA复制压力。
2)通过微核计数发现,与对照细胞相比,RPA1(?)(?)表达细胞中MN-γ-H2AX(+)的发生频率有所增高。
综上所述,MN-γ-H2AX(+)是一种新型微核,它不同于传统意义上有丝分裂后期形成的微核,主要是在细胞分裂间期形成的。我们推测这类微核的形成原因是细胞在S期遭遇DNA复制压力,进而导致了大量的DNA双链断裂损伤,这些无法修复的损伤部位聚集在一起排出细胞主核,形成MN-γ-H2AX(+)。研究这类新型的MN-γ-H2AX(+)有助于我们认识DNA复制压力所引起的基因组不稳定性,以及评估导致DNA复制压力的遗传和环境因素。

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