活性氧(ROS)导致MN-γ-H2AX(+)发生频率增高

第一部分的研究证明DNA复制压力能够诱发MN-γ-H2AX(+),且有多项研究证明ROS能够导致不同形式的DNA损伤,因此我们接下来研究了ROS水平与MN-γ-H2AX(+)形成之间的关系。我们使用药物影响ROS水平以及使用具有抗氧化基因缺陷的细胞进行实验,检测MN-γ-H2AX(+)的发生频率;同时使用具有抗氧化作用的药物对以上细胞进行联合处理,Brefeldin A,以抑制细胞内ROS水平的增高,分析ROS与MN-γ-H2AX(+)形成的关系。
1.使用导致ROS水平增高的药物过氧化氢(H202)以及具有抗氧化作用的药物N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理细胞,结果如下:
1)使用不同浓度的H2O2(50μM,100μM,150μM)处理U20S细胞不同时间(2h,6h,12h,24h),随后更换为新鲜完全培养基释放48h,检测MN-γ-H2AX(+)的形成情况。结果显示,H202能够诱发MN-γ-H2AX(+),且呈剂量依赖性和时间依赖性。
2)使用具有抗氧化作用的药物NAC与H202联合处理细胞,结果发现,NAC能够下调H202所造成的MN-γ-H2AX(+)发生频率的增高。从而通过药物实验证明了ROS能够诱发MN-γ-H2AX(+)。
2.通过不同方式使具有抗氧化作用的基因p53功能改变后,ONX-0914,检测MN-γ-H2AX(+)发生频率的变化情况。结果如下:
1)使用p53激活剂nutlin-3处理U20S细胞,MN-γ-H2AX(+)的发生频率有所降低。
2)使用p53抑制剂pifithrin-α处理U20S细胞,MN-γ-H2AX(+)的发生频率有明显增高。
3)使用p53功能缺陷的U20S细胞以及p53缺失的小鼠皮肤成纤维细胞进行实验,结果发现:与对照细胞相比,p53功能缺陷的细胞中,MN-γ-H2AX(+)的发生频率有明显增高。
4)使用具有抗氧化作用的药物NAC处理p53功能缺陷细胞及其对照细胞,结果发现:NAC能够下调由于p53功能缺陷而导致的MN-γ-H2AX(+)发生频率的增高。
3.为了了解p53下游基因对MN-γ-H2AX(+)形成的影响,我们使用siRNA抑制p53下游具有抗氧化作用的基因SESNl的表达。结果发现,与对照细胞相比,SESN1低表达的细胞中,I-BET-762,MN-γ-H2AX(+)的发生频率有所增高。
4.有文献报道p400受到抑制后,细胞内ROS水平有所增高。因此,我们使用p400低表达的U20S细胞进行实验,结果发现p400表达量降低后,MN-γ-H2AX(+)的发生频率明显增高。进一步证明了ROS能够诱发MN-γ-H2AX(+)。
综上所述,ROS水平增高能够诱发MN-γ-H2AX(+)。

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