MDM2介导RARα泛素化降解的机制研究

目的:在前两部分的研究中,我们发现了两个RARα泛素化降解过程的可能调控因子,而蛋白质依赖于泛素蛋白酶体通路的降解是一个由多种酶介导的复杂而有序的分子过程。其中泛素E3连接酶在整个过程中起着中心调节作用,其通过特异性地识别靶蛋白决定着整个过程的精确性。Fostamatinib,因此寻找RARα泛素化过程的泛素E3连接酶对于更好地理解RARα泛素化降解过程的调控具有积极的推动作用。在前期能与RARα结合的蛋白的筛选过程中,我们发现了MDM2这一细胞内重要的泛素E3连接酶,因此本部分的研究我们将在确定MDM2能够促进RARα泛素化降解的基础上致力于探讨MDM2是否可能为RARa的泛素E3连接酶。
方法与结果:我们在U20S细胞中采用ATRA作用后,细胞内RARcα蛋白发生时间依赖性下调。同时我们发现出核抑制剂LMB能够显著逆转ATRA引起的RARa蛋白下调,即ATRA诱导的RARa泛素化降解发生于细胞质中。Westernblotting及免疫荧光实验则证实,ATRA短时间处理U2OS细胞后,细胞内MDM2蛋白发生上调,并在细胞质中累积,这一结果提示MDM2可能与ATRA触发的RARa泛素化降解有关。为了深入研究这一作用,我们在U2OS细胞中过表达了MDM2蛋白,Westernblotting结果显示,MDM2依赖于其泛素连接酶活性促进RARα蛋白下调,而这一作用在ATRA处理后更甚。同时我们构建了MDM2稳定低表达的U20S细胞株,并对其中RARα蛋白水平进行了检测。结果表明,MDM2低表达上调了RARcα蛋白水平,并增强了其蛋白稳定性。进一步研究显示,MDM2高表达促进了ATRA引起的RARα多聚泛素化水平,而低表达则反之。同时体外泛素化实验证实,MDM2的泛素连接酶活性在RARα的多聚泛素化过程中是不可或缺的。SB-715992,另一方面,我们采用免疫荧光技术发现内、外源性的MDM2及RARα均存在一定的共定位,免疫沉淀结果则进一步证实MDM2能与RARα发生相互结合,并且ATRA能够促进两者的结合。在此基础上,采用免疫沉淀技术我们发现MDM2蛋白上第1-109位氨基酸所在的结构域为RARcα蛋白的结合位点,而同样能够结合于MDM2蛋白该结构域的小分子化合物Nutlin-3则能显著干扰MDM2-RARα的结合。同时,Westernblotting结果证实,缺失RARα结合结构域的MDM2蛋白不能促进RARα的下调,而Nutlin-3则能够显著逆转ATRA引起的RARα蛋白下调,提示MDM2促进RARα泛素化降解的作用依赖于与RARcα蛋白的相互结合。R406,基于MDM2对RARα蛋白的负性调控,我们对MDM2在ATRA诱导的U20S细胞分化过程中的作用进行了研究。结果表明,高表达MDM2抑制了ATRA引起的U2OS细胞生长抑制.OPN、RUNX2、ALP等分化标记蛋白的上调及细胞内ALP活性的增加,即过表达MDM2抑制ATRA诱导的U2OS细胞分化,而低表达MDM2则相反。同时,MDM2泛素连接酶活性抑制剂HLI373被发现能够显著上调RARα蛋白,降低其由ATRA引起的多聚泛素化水平,并协同ATRA增强U2OS及原代骨肉瘤细胞的分化水平。
结论:MDM2通过与RARα蛋白的结合并依赖于泛素连接酶活性介导RARα的泛素化降解,可能为RARα的泛素E3连接酶。

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