热休克蛋白27及其磷酸化对p53的调控及介导MCF-7细胞多柔比星耐受的研究

p53作为一个重要的抑癌基因,一方面调控着促进细胞凋亡的过程,另一方面通过调控细胞周期从而调节应激条件下细胞修复机制。在很多肿瘤细胞中都伴随着热休克蛋白27(Hsp27)的高表达,它是热休克蛋白家族中可以被磷酸化修饰的小热休克蛋白的典型代表。Hsp27调节p53蛋白水平和其激活已有报道,但对于涉及Hsp27磷酸化修饰在此过程中作用的研究并不系统和完整。BAY 73-4506,本课题就Hsp27及其磷酸化形式对于p53蛋白的调控,下游信号的激活和相关信号通路等都做了较为深入和系统的研究。
首先,本研究发现Hsp27参与了调节p53蛋白稳定性和激活的过程。在人胚肾细胞株HEK293A细胞中的研究发现,Hsp27能下调外源性p53引起的p21转录激活,并且抑制了由此引起的细胞周期阻滞。在细胞内通过瞬时转染过表达外源性Hsp27发现Hsp27可以显著增强p53的泛素化,但是却对p53下游的MDM2的表达呈现剂量效应的抑制作用。通过对于p53下游p21,MDM2的抑制和对p53本身泛素化的促进,表明Hsp27对p53具有负向调控的功能,LY335979,从而缓解由于p53引起的细胞周期阻滞。
Hsp27是一种可以被磷酸化修饰的小热休克蛋白,其磷酸化和非磷酸化形式均在细胞的增殖、凋亡、分化、炎症等多种生理病理过程中发挥了不同的生物学功能。在本文中,我们发现并报道了磷酸化的Hsp27发挥着与非磷酸化的Hsp27不同的作用:1)过表达磷酸化Hsp27突变体(Hsp27-3D)促进了p53的激活,但是长时间作用后促进了p53的下调;2)过表达Hsp27-3D促进了p53的核聚集,而过表达非磷酸化Hsp27突变体(Hsp27-3A)并没有表现出这种p53趋核聚集的现象,相反的出现了出核增加的趋势;3)磷酸化的Hsp27促进了ATM的激活,从而增强了p53/p21信号级联反应。这些结果都表明Hsp27磷酸化后对于p53的激活发挥了重要的作用。
多柔比星(Dox)是一种常用的DNA毒抗癌药物,容易在细胞核内聚集并导致细胞凋亡。在最后一部分中,Ganetespib,我们发现亚致死剂量的Dox可以引起具有野生型p53的乳腺癌细胞MCF-7中Hsp27,ATM和p53的磷酸化,磷酸化后的Hsp27增加了与ATM,p53形成三元复合物的水平,从而引起p21的积累。而当使用多种手段抑制Hsp27磷酸化后,ATM和p53磷酸化也同时被抑制,进而阻断了p21蛋白水平的上调和其介导的细胞保护作用,引起细胞凋亡的增加。这些结果表明磷酸化的Hsp27通过增加与ATM的结合从而激活p53,通过p53/p21通路对细胞进行保护性调节。
综上所述,本研究首次揭示了Hsp27磷酸化形式对于p53激活和蛋白水平的调控作用;提出了Hsp27在胞内发挥保护作用的新的作用机制。这些结果对深入研究Hsp27在细胞周期,肿瘤耐受等多种生理病理条件下的调节作用具有重要的指导意义。

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