BMI-1在骨肉瘤中的表达及功能研究

背景骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,来源于间叶组织,可发生于任何年龄,尤其好发于青少年,预后差。骨肉瘤恶性程度及转移率高,其远处转移是大多数骨肉瘤患者治疗失败和死亡的最主要原因。从目前情况来看,虽然5年生存率已经达到65-75%,但在诊断、治疗和预后等方面仍存在不足。为此,发现并建立新的、有效的骨肉瘤的诊治措施势在必行,探索早期诊断、预后评判标准和开发新的治疗药物(非化疗药)是当前骨肉瘤临床诊治中热门的研究方向。文献表明,BMI-1基因在肿瘤方面的研究证据非常丰富。但目前国内、外对于该基因与骨肿瘤的相关性研究却较为缺乏,因此我们将研究重点锁定在BMI-1与骨肉瘤之间的相关性研究上。
目的构建人BMI-1基因相关shRNA慢病毒载体,包装成病毒颗粒后感染骨肉瘤细胞株后,观察抑制BMI-1表达水平对肿瘤细胞增殖、侵袭能力、细胞周期以及对化疗药物敏感性的影响。并通过回顾性研究探讨BMI-1在骨肉瘤细胞中的表达及其与临床病理及预后的关系。
方法用慢病毒介导的BMI-1shRNA转染人骨肉瘤细胞株SAOS-2和U20S,并通过Real-timePCR和WesternBlot检测转染后BMI-1的表达情况。运用MMT实验、PI-FACS实验、平板克隆实验、Tanswell细胞侵袭实验、流式双染实验对转染后的人骨肉瘤细胞株的恶性表型进行检测。同时对北京协和医院的16例骨肉瘤、9例软骨肉瘤、11例骨软骨瘤、2例尤文氏肉瘤进行免疫组化实验,临床验证BMI-1与骨肉瘤的关系。
结果慢病毒介导的RNAi持续的、显著的降低了BMI-1表达。PHA-665752,在体外实验中,下调BMI-1表达显著影响了人骨肉瘤细胞的恶性表型,降低了增殖能力、侵袭能力,增加了对于顺铂化疗的敏感性,但对于细胞周期无显著性影响,并通过回复对照实验证实该基因的特异性,同时发现BMI-1RNAi对肿瘤细胞的增殖、侵袭抑制作用及增加肿瘤细胞对顺铂化疗敏感性具有一定的细胞特异性。临床病例研究证实BMI-1存在于骨肉瘤(12/16)、骨软骨瘤(1/11),软骨肉瘤(6/9)、尤文氏肉瘤(1/2)中,但在非肿瘤骨组织中没有表达(0/10)。骨肉瘤中BMI-1阳性表达率显著高于骨软骨瘤及非肿瘤骨组织(P<0.05)。ZSTK474,恶性骨肿瘤中BMI-1阳性表达率显著高于良性骨肿瘤(P<0.05)。BMI-1阳性表达情况与骨肉瘤病例组临床病理特点无显著性关联。在单因素生存分析中,除术前是否转移与病例生存期存在显著关联(P<0.05)外,余项目均无显著关联。在Cox比例风险回归模型中,所有结果均无显著性。但根据相对危险度来看,病理分级、Enneking外科分期、术后转移复发、BMI-1表达情况四项对于骨肉瘤病人的预后存在一定影响。
结论构建了干扰BMI-1的慢病毒体系,感染人骨肉瘤细胞系SAOS-2和U20S,经Real-timePCR以及WesternBlot检测,能有效干扰BMI-1的表达,为骨肉瘤细胞功能研究打下坚实的基础。
体外实验结果显示:干扰BMI-1后能显著抑制人骨肉瘤细胞的增殖、侵袭能力,并提高其对于顺铂的敏感性,提示BMI-1在骨肉瘤的发生发展中作用显著,为骨肉瘤分子靶向治疗开辟了一个崭新的方向,其很可能成为骨肉瘤分子治疗的靶点之一。
运用免疫组化方法证实了BMI-1蛋白在骨肿瘤组织(包括骨软骨瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤)中的表达,SB216763,并且证明BMI-1蛋白在恶性骨肿瘤中的表达率明显高于良性骨肿瘤。研究提示BMI-1很可能会成为骨肉瘤等恶性骨肿瘤的诊断指标之一。
BMI-1基因的表达与临床分期、病理分级、年龄、性别、肿瘤部位、术前转移、软组织浸润等因素无显著性关联。研究提示需进一步研究证实,更深层次挖掘BMI-1与骨肉瘤患者临床病理特点的相关性及规律。
骨肉瘤病人生存因素分析提示病人术后生存期与术前是否转移存在统计学意义,Cox回归模型提示病理分级、Enneking外科分期、术后转移复发、BMI-1表达情况四项对于骨肉瘤病人的生存期存在一定影响。研究提示需要进一步研究来分析骨肉瘤患者的预后影响因素,并验证BMI-1是否可以成为骨肉瘤预后评判的一个指标。

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