奶山羊雄性生殖干细胞(mGSCs)减数分裂相关信号途径的探索

雄性生殖干细胞(mGSCs),也称作精原干细胞(SSCs),是近年来发育生物学最具有吸引力的研究热点之一,雄性生殖干细胞的研究在生物医学、畜牧生产等领域都具有广泛的应用前景。奶山羊雄性生殖干细胞主要定位于睾丸曲细精管基底膜,是奶山羊睾丸内精子发生的基础,精子生成于睾丸的曲细精管内。雄性生殖干细胞的减数分裂受许多基因的精确时序调控。目前,IKK inhibitor,已发现了一些基因会促进小鼠生殖细胞减数分裂的起始,但是关于奶山羊雄性生殖干细胞减数分裂的研究还较少,相关机理还很不清楚。
本研究检测了不同时期奶山羊睾丸组织中Boule、Stra8、P53和miR-34c的表达情况,对分离纯化得到的奶山羊mGSCs进行生殖细胞及多能性细胞标志基因和蛋白表达的检测。随后通过在奶山羊mGSCs上过表达相关基因,并对减数分裂其它相关基因进行检测来确定它们之间是否存在调控关系。我们在奶山羊mGSCs上发现的相关信号途径有:(1)Boule可以直接调控Stra8的表达并促进其转录和翻译,进而可能促进减数分裂的进行;(2)过表达P53可以激活miR-34c的表达,miR-34c表达是P53依赖性的;(3)过表达Boule和Stra8可以上调miR-34c的表达,但不是通过P53引起的。
1.Boule促进mGSCs的减数分裂
Boule是减数分裂过程中一个相对保守的基因,它编码的RNA结合蛋白是精母细胞进行减数分裂所必需的。Integrase 抑制剂,BOULE蛋白的缺失会阻滞精子发生过程中减数分裂的启动进而造成不育。至今为止,Boule在奶山羊睾丸组织中的表达规律和功能均不清楚。实验证实Boule在成年奶山羊睾丸组织中表达量明显高于青春期、胎羊以及间性羊和无精羊。在mGSCs上过表达Boule48h后,减数分裂相关基因的表达也明显上调,Stra8上调最为明显,通过Western-blot和荧光素酶报告基因载体技术,进一步证实Boule可以直接作用于Stra8并上调其表达。同时我们在奶山羊mGSCs上过表达Boule的下游基因Cdc25A,并未检测到Stra8表达水平有明显改变,而RA可以诱导Boule和Stra8的表达。结果证实Boule在奶山羊精子发生过程中发挥着重要的功能,过表达Boule可以促进奶山羊的减数分裂和精子发生。
2.miR-34c受P53调控并促进mGSCs的凋亡
MicroRNA(miRNA)是一类对基因进行转录后调控的非编码小RNA。已有的证据表明miRNAs在一系列生物学过程发挥重要功能,然而miR-34c在雄性生殖干细胞的研究比较少。我们将miR-34c模拟物和抑制剂转染mGSCs,通过形态学观察、Brdu染色、流式细胞术、Q-RT-PCR和Western-blot等检测发现miR-34c可以促进mGSCs的凋亡,降低其增殖能力,并阻滞细胞周期。Mdm2 inhibitor,在mGSCs中过表达P53也可以发现miR-34c的表达有明显上调。因此,我们得出结论:miR-34c可以促进mGSCs的凋亡并降低其增殖能力,并且miR-34c是依赖P53调控的。
3.mGSCs中过表达Boule和Stra8不通过P53上调miR-34c的表达
生殖是所有动物赖以生存的基础,精子发生是完成繁殖所必须经历的过程,精子发生是一个复杂的发育过程其最终目的是源源不断的产生单倍体精子。当前研究已表明:Boule和Stra8在雄性生殖细胞的减数分裂起始过程中发挥重要作用,而miR-34c是精子发生过程后期完成所必不可少的miRNA,但是其主要功能是促进多种细胞凋亡。我们发现过表达Boule和Stra8可以上调miR-34c的表达,在我们先前研究已证实miR-34c是P53依赖性的,所以我们进一步探索Boule和Stra8造成的miR-34c的上调是不是通过P53引起的,发现过表达Boule和Stra8后,细胞的增殖能力变化不大,同时P53在mRNA和蛋白水平的表达也无明显改变,所以Boule和Stra8上调miR-34c可能是促进mGSCs减数分裂造成的。

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