应用Western Blot技术检测人卵巢癌细胞系A2780、OVCAR3、SKOV3、HO8910和HO8910/PM中IL-1

应用Western Blot技术检测人卵巢癌细胞系A2780、OVCAR3、SKOV3、HO8910和HO8910/PM中IL-17RA的蛋白表达水平,为后续研究提供实验依据。2.应用MTT技术检测不同浓度外源性rh selleck合成 IL-17A对五种人卵巢癌细胞系和小鼠上皮性卵巢癌细胞系ID8增殖水平的影响,应用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分析癌干细胞标记分子的m RNA和蛋白表达水平。3.应用细胞划痕实验检测外源性rm

IL-17A对小鼠卵巢癌细胞系ID8迁移活性的影响。应用8.0μm Transwell小室侵袭实验检测外源性rm IL-17A和/或小鼠原代网膜脂肪细胞对ID8细胞侵袭能力的影响。应用3.0μm Transwell小室进行ID8与小鼠原代网膜脂肪细胞共同培养,应用Western Blot技术分析外源性rm IL-17A和/或网膜脂肪细胞对ID8细胞MMP-2和FABP4的蛋白表达水平的影响。应用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测外源性IL-17A对相关信号分子STAT3和NF-κB的表达水平及磷酸化水平的影响。4.利用C57 BL/6遗传背景的野生型(WT)和IL-17-/-小鼠,建立小鼠腹腔种植瘤和卵巢原位种植瘤两种卵巢癌动物模型,观察内源性IL-17对腹腔内成瘤、原位成瘤和转移的影响,应用免疫组化技术观察瘤组织中IL-17A、MMP-2和FABP4的表达。5.收集不同FIGO分期的卵巢癌临床标本,分析IL-17A、MMP2、FABP4表达与肿瘤临床进展、转移、预后的相关性。6.应用MTT技术检测人卵巢癌细胞系A2780、OVCAR3和SKOV3对顺铂(DDP)的敏感性,分析外源性rh IL-17A对其顺铂敏感性的影响。选择顺铂敏感细胞系A2780和顺铂耐药细胞系OVCAR3为研究对象,应用流式细胞术分析外源性rh IL-17A对细胞经顺铂作用后细胞凋亡水平和细胞周期分布的变化。7.应用实时荧光定量RT-PCR技术检测耐药相关基因ABCG2和TUBB3的m RNA表达水平,应用Western Blot技术检测ABCG2的蛋白表达水平。8.利用C57 BL/6遗传背景的WT和IL-17-/-小鼠,建立小鼠腹腔种植瘤卵巢癌动物模型,观察内源性IL-17对DDP治疗敏感性的影响。9.收集原发性和复发性上皮性卵巢癌临床病理标本,应用免疫组化技术分析IL-17A和ABCG2与卵巢癌临床分期、预后的相关性。结果:1.人卵巢癌细胞系可组成性表达IL-17RA。2.外源性rh

IL-17A不影响卵巢癌细胞的增殖水平。0.1ng/m L和100ng/m L rh IL-17A可显著促进A2780、OVCAR3和SKOV3细胞癌干细胞标记分子Oct3/4的m RNA表达水平;但对其Oct3/4的蛋白表达水平无显著作用。3.小鼠上皮性卵巢癌细胞系ID8和小鼠网膜原代脂肪细胞可组成性表达IL-17RA。外源性rm IL-17A可促进ID8细胞的迁移活性,且呈剂量依赖性。外源性rm SB203580小白鼠 IL-17A可直接促进ID8细胞的侵袭能力;IL-17-/-小鼠和WT小鼠的网膜原代脂肪细胞对ID8细胞的侵袭能力均有促进作用,但WT小鼠脂肪细胞的促侵袭活性明显强于IL-17-/-小鼠;加入外源性rm selleck产品 IL-17A后,可进一步增强WT小鼠脂肪细胞对ID8细胞侵袭能力的活性作用;上述作用与IL-17A促进ID8细胞FABP4的蛋白表达水平密切相关,FABP4抑制剂BMS 309403可抑制IL-17A的促侵袭能力。1ng/m L IL-17A作用卵巢癌细胞3h和6h后,可显著促进STAT3

705位点Tyr的磷酸化水平;经STAT3抑制剂HO-3867作用2h后,可显著抑制IL-17A对STAT3信号通路的激活作用,抑制IL-17A对ID8细胞FABP4的蛋白表达水平的上调作用,表明IL-17A主要经STAT3信号通路上调FABP4的表达。4.内源性IL-17可显著减少腹腔种植瘤小鼠的生存时间,促进卵巢癌腹腔内成瘤和原位成瘤。WT小鼠肿瘤组织中IL-17A+细胞呈强阳性表达,未观察到IL-17-/-小鼠肿瘤组织中IL-17A+细胞的表达;WT小鼠肿瘤组织中MMP-2和FABP4均呈强阳性表达,IL-17-/-小鼠肿瘤组织中MMP-2和FABP4呈弱阳性表达。5.临床标本分析表明,IL-17A、FABP4、MMP-2的表达强弱与卵巢癌FIGO分期、淋巴结转移、腹水转移等呈正相关;IL-17A与FABP4、MMP-2的表达水平具有正相关性,进一步证实IL-17A可上调FABP4等转移相关因子的表达。6.A2780、OVCAR3和SKOV3对DDP的敏感性存在差异,A2780为DDP敏感细胞系,OVCAR3和SKOV3为DDP耐药细胞系。与对照组相比,低浓度和高浓度rh IL-17A均显著降低DDP对A2780、OVCAR3细胞的增殖抑制率,仅高浓度rh IL-17A可降低DDP对SKOV3细胞的增殖抑制率。与对照组相比,0.1ng/m L rh IL-17A对A2780和OVCAR3细胞的凋亡水平无明显影响;经0.1ng/m L rh IL-17A预处理2hrs后,DDP对A2780细胞的毒性作用明显减弱。与对照组相比,0.1ng/m L rh IL-17A不影响作用A2780和OVCAR3细胞的周期分布;DDP可使A2780和OVCAR3的G0/G1期比例减少,G2+S期比例增加,表明DDP可使细胞周期阻滞于G2期,抑制细胞增殖;经0.1ng/m L rh IL-17A预处理后,再加入DDP,IL-17可影响由DDP造成的细胞周期阻滞,使A2780和OVCAR3的G0/G1期比例增加,G2+S期比例减少。7.A2780组成性低表达耐药相关蛋白ABCG2,OVCAR3和SKOV3细胞可组成性高表达ABCG2。与对照组相比,外源性rh IL-17A可显著促进A2780细胞的ABCG2的m RNA与蛋白表达水平,表明IL-17A对卵巢癌耐药性的促进作用与上调ABCG2表达密切相关。8.小鼠卵巢癌腹腔种植瘤动物模型研究表明,内源性IL-17可抑制DDP对腹腔内肿瘤生长的细胞毒性作用。9.

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