Ox-LDL诱导BMSCs增殖和迁移,上调Akt2、MMP-2表达,下调Akt1、eNOS表达;LOX-1单抗或let-7g类似物

Ox-LDL诱导BMSCs增殖和迁移,上调Akt2、MMP-2表达,下调Akt1、eNOS表达;LOX-1单抗或let-7g类似物能抑制ox-LDL诱导的BMSCs增殖和迁移。 结论: 1、Ox-LDL能被小鼠BMSCs吞噬,诱导MSCs增殖和迁移,对MSCs凋亡无明显影响; 2. Ox-LDL诱导的小鼠BMSCs增殖和迁移与let-7g/LOX-1-Akt2信号通路相关 第一部分小鼠BMSCs体外扩增及ox-LDL对BMSCs凋亡的影响 目的:体外分离培养小鼠BMSCs,探讨ox-LDL对其凋亡的影响。 www.selleckchem.cn/products/Sunitinib-Malate-(Sutent).html 方法:采用密度梯度离心法+贴壁培养法分离扩增小鼠BMSCs,采用MTT方法测定MSCs的生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞表面抗原表达,成脂诱导分化鉴定BMSCs分化能力。Annexin-V/PI及TUNEL检测ox-LDL对MSCs凋亡的影响。 结果:刚分离的小鼠骨髓细胞呈圆形,经多次换液、传代后去除悬浮细胞,可见MSCs贴壁生长,第三代细胞行流式细胞术检测表面抗原,显示CD29阳性,而CD31、CD34、CD45阴性,成脂分化示MSCs能分化为脂肪细胞。Annexin-V/PI细胞凋亡检测示不同浓度ox-LDL(0、10、20、40μg/mL)干预24h后MSCs凋亡率分别为2.0±0.9%、3.2±1.2%、3.9±1.8%、4.3±2.2%,凋亡率差异无显著性(P>0.05);20μg/mL的ox-LDL干预0、6、12、24h后MSCs凋亡率分别为2.3±0.8%、3.4±1.2%、4.2±1.6%、3.9±1.4%,凋亡率差异无显著性(P>0.05);TUNEL细胞凋亡检测示不同浓度ox-LDL(0.10、20、40μg/mL)干预24h后MSCs凋亡率分别为2.1±1.0%、2.9±1.2%、4.0±0.9%、3.7±1.3%,凋亡率差异无显著性(P>0.05);20μg/mL的ox-LDL干预0、6、12、24h后MSCs凋亡率分别为2.5±0.7%、3.7±1.3%、4.2±1.2%、4.0±1.0%,凋亡率差异无显著性(P>0.05)。

结论:本课题采用密度梯度离心法+贴壁培养法成功地分离和体外扩增出较为均一的BMSCs。短时间低至中浓度的ox-LDL对MSCs凋亡无明显影响。 第二部分Let-7g/LOX-1介导MSCs吞噬ox-LDL 目的:观察小鼠BMSCs对ox-LDL的吞噬及微小RNA let-7g和膜受体LOX-1在其中的作用。 方法:采用ELISA方法检测MSCs是否能吞噬ox-LDL,实时定量PCR和/或检测western

blot检测ox-LDL干预后let-7g和LOX-1表达水平的变化;分别采用LOX-1特异性拮抗剂LOX-1单抗以及let-7g类似物预处理细胞,检测MSCs对ox-LDL吞噬作用的改变程度。 结果:20μg/mL ox-LDL干预MSCs24h后细胞内ox-LDL浓度显著升高,为无ox-LDL干预对照组的6.0±0.8倍,P<0.05;LOX-1蛋白表达水平分别为1.0±0.3、2.0±0.2、3.2±0.3、3.1±0.4,ox-LDL干预组与对照组比较,差异有显著性,P<0.05;LOX-1蛋白表达水平分别为1.0±0.2、1.7±0.3、2.7±0.3、3.2±0.2,ox-LDL干预组与对照组比较,差异有显著性,P<0.05。LOX-1单抗或let-7g类似物均能显著对抗MSCs对ox-LDL的吞噬作用,分别为2.0±0.2vs6.0±0.8,P<0.05及1.7±0.3vs6.0±0.8,P
线粒体是细胞内能量代谢“工厂”,是细胞代谢的重要器官。线粒体具有半自主性,即线粒体拥有独立的DNA,从而使得线粒体蛋白受到细胞核DNA与线粒体DNA双重调控。己知99%的线粒体蛋白由细胞核DNA编码调控,需要经过在细胞质中转录、翻译形成携带特殊信号序列的前体蛋白,这些前体蛋白在细胞质伴侣蛋白的协助下,通过位于线粒体膜上蛋白输入系统,输入到线粒体特定不同区域。输入至线粒体的前体蛋白在基质伴侣蛋白作用下形成成熟蛋白,最终在线粒体呼吸链或线粒体基质中发挥作用。由此看来,骨骼肌线粒体蛋白输入系统是影响骨骼肌线粒体生物发生的重要环节,是线粒体生物发生得以顺利进行的物质保证。线粒体蛋白输入机制(PIM, 或者 Selleckchem PLX-4720 Protein Import Machinery)涉及线粒体蛋白输入系统相关组件及不同线粒体蛋白输入通路的功能。其中,线粒体蛋白输入系统的组件构成非常复杂,包括线粒体外膜转移酶复合物TOM、线粒体内膜转移酶复合物TIM、线粒体基质伴侣蛋白以及细胞质中协助前体蛋白输入的伴侣蛋白等诸多组件。 目的:本研究主要以PGC-1α、Bax/Bak基因为切入点,根据PGC-1α、Bax/Bak基因的不同特征,通过分别深入研究PGC-1α、Bax/Bak基因与线粒体PIM组件蛋白表达以及线粒体PIM功能的关系,探讨不同应激对线粒体PIM组件蛋白表达及功能调节的分子作用机制,一方面首次关注PGC-1α、Bax/Bak基因是否对线粒体PIM具有调节作用,另一方面揭示调节线粒体PIM的分子机制。

方法: 1. PGC-1α基因对骨骼肌线粒体PIM作用机制研究 1)细胞水平对PGC-1α基因的基础性研究:采用C2C12肌细胞模型,对C2C12细胞进行分化,生成可收缩的成熟肌管细胞。实验主要采用急性电刺激成熟肌细胞模型以及结合使用多种特异性抑制剂:如NAC (ROS↓)、BAPTA-AM (Ca2+↓)、Compound c (AMPK↓)、BIRB796(p38↓)等。观察急性电刺激条件下,不同分子信号通路对PGC-1α基因在转录水平以及翻译后蛋白水平的调控。 实验Ⅰ:分为对照组、急性电刺激组以及急性电刺激恢复组。Western Blot方法检测PGC-1α基因相关分子信号通路蛋白表达,免疫荧光法检测急性电刺激对肌管细胞内PGC-1α蛋白迁移的影响。 实验Ⅱ:分为对照组、对照组+抑制剂处理组、急性电刺激组、急性电刺激+抑制剂处理组。在肌细胞内利用细胞转染技术,转染预构建的i)含小鼠PGC-1α基因启动子全序列的荧光素质粒或ii)含PGC-1α蛋白DNA全序列的荧光素质粒,荧光素酶检测法分别检测不同分子信号通路对PGC-1α基因转录活性以及辅激活转录活性的影响。 2)动物水平对PGC-1α基因与线粒体PIM关系进行研究:采用PGC-1α基因敲除鼠动物模型,对比研究PGC-1α野生型及基因敲除小鼠骨骼肌线粒体PIM组件蛋白表达以及PIM功能。 实验分组:PGC-1α WT组与PGC-1α KO组。Western Blot方法检测不同线粒体PIM组件蛋白表达,放射性同位素35s标记示踪法检测线粒体PIM功能。 2.

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