2)。分别在指定时间点测量每组大鼠PaO2、PaCO2以及肺组织炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)含量、支气管肺泡灌洗液

2)。分别在指定时间点测量每组大鼠PaO2、PaCO2以及肺组织炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)含量、支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞计数、肺血管通透性、肺组织湿/干重比值(W/D)、肺组织HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA含量。另外,分别用海水(1300mOsm/kgH2O)、高渗山梨醇溶液(1300mOsm/kgH2O)、高渗白蛋白溶液(1300mOsm/kgH2O)和双蒸水(0mOsm/kgH2O)处理NR8383细胞,各组溶液保持相同的温度(25℃)和pH值(8.2),观察不同渗透压梯度和时间点下NR8383细胞HIF-1α蛋白和mRNA含量变化,并观察缺氧和高渗联合作用对上述细胞HIF-1α蛋白和mRNA含量变化的影响。此外,应用ATM、PI3K、p38的抑制剂KU55933、LY294002、SB203580及CHX研究高渗调节HIF-1α表达的可能机制。最后,应用HIF-1α的小干扰RNA技术和测量单层细胞通透性的方法研究高渗环境下HIF-1α在炎症反应和肺血管通透性调节中的作用。

结果:用高渗液体(海水和高渗山梨醇)气管内滴入组大鼠肺组织缺氧、炎症因子水平、肺血管通透性、肺水肿都明显高于用等渗和低渗液体(等渗海水、等渗山梨醇和淡水)滴入组,同时伴有HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA含量的明显增加。在NR8383细胞上证明了是海水中的高渗因素而不是离子、温度、pH值等其它因素导致的HIF-1α蛋白和mRNA含量的增加;同时,发现高渗和缺氧可以协同作用增加HIF-1α蛋白。此外,实验表明高渗通过增加ATM和PI3K的磷酸化水平上调了HIF-1α mRNA的表达进而使HIF-1α蛋白含量增加,并且通过增加p38的磷酸化水平抑制了HIF-1α蛋白的降解进而使可检测到的HIF-1α蛋白含量增加。最后,我们验证了高渗环境下HIF-1α促进NR8383细胞产生炎症因子,同时HIF-1α通过增加VEGF蛋白表达使RLMVEC单层细胞通透性增加。

结论:海水淹溺导致的肺部高渗和缺氧环境协同增加了肺组织HIF-1α表达,增加了的HIF-1α通过提高肺组织炎症因子水平和肺血管通透性进而加重了肺部炎症反应和肺水肿。
研究背景: 海水淹溺是航海、海上作战、作业时常发生的意外伤害事故,吸入海水可导致肺泡-毛细血管膜损伤并伴有通透性增高,富含蛋白的液体聚集于肺泡腔,引起海水淹溺型肺水肿(pulmonary edema induced by seawaterdrowning,PE-SWD),是海水淹溺引起死亡的主要原因之一。PE-SWD的主要病理变化是肺通透性增高,肺水肿形成,引起低氧血症和呼吸困难。如不及时救治和控制病情,易发展为海水型呼吸窘迫综合征(seawaterrespiratory P450 抑制剂 distress syndrome, SW-RDS)。SW-RDS是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的一种。近年来关于PE-SWD/SW-RDS的研究逐渐增多,但是其发病机制仍不完全清楚,缺乏有效的治疗手段,死亡率仍很高。PE-SWD/SW-RDS时,肺泡上皮屏障功能破坏,肺水肿液的清除功能障碍,加之吸入的高渗海水在肺泡内聚集,驱使血管内液体沿渗透压力梯度流向肺泡内,加重缺氧。 缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)在肺泡上皮和毛细血管内皮普遍存在,是细胞间缝隙连接的基本组成单位,不仅发挥细胞间的通讯功能,而且对细胞的生长、分化和凋亡甚至肿瘤形成都有重要作用。有文献报道Cx43与血管通透性有关。近年来研究表明Cx43参与肺损伤的过程,但Cx43在PE-SWD/SW-RDS中的作用及其机制尚不清楚。本实验通过复制大鼠海水淹溺型肺水肿的模型,观察Cx43在海水淹溺型肺水肿中的作用,并进一步研究其可能的作用机制。 实验目的: ⑴观察大鼠海水淹溺型肺水肿模型中Cx43的表达变化。

⑵探讨Cx43在海水淹溺型肺水肿中的作用及其机制。 实验方法: 实验一 体内实验 24只SD大鼠随机分为4组,正常对照组(0h)、海水淹溺1h组(1h)、4h组(4h)和8h组(8h)。气管内滴注海水的方法复制大鼠海水淹溺型肺水肿的模型,通过肺组织湿干重比值(W/D)、支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量和伊文思蓝漏出指数(ELI)测定肺组织的通透性;RT-PCR和Western Blot等分子生物学实验方法检测肺组织Cx43的含量变化。 体外实验 采用25%体积浓度的海水孵育A549细胞模拟海水淹溺的肺内环境(作用时间为4小时),观察Cx43的表达变化。A549细胞随机分为2组:空白对照组(Control)、海水组(SW),通过RT-PCR和Western 而且 Blot方法检测海水对Cx43的表达的影响。通过对FITC标记的葡聚糖的相对通透性测定单层A549细胞的通透性,观察海水对单层细胞通透性的影响。 实验二 (一)A549细胞随机分为空白对照组(Control)和海水组(SW),WesternBlot方法检测海水对MAPK信号通路的作用。 (二)分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞随机分为5组:空白对照组(Control)、海水组(SW)、ERK1/2抑制剂组(PD)、JNK抑制剂组(SP)、p38抑制剂组(SB),并设阴性对照组。通过FCM分析细胞膜Cx43的表达量。 (三)A549细胞随机分为6组:空白对照组(Control)、海水组(SW)、ERK1/2抑制剂组(PD)、JNK抑制剂组(SP)、p38抑制剂组(SB)和反义寡核苷酸干预组(ASODN)。通过Western Blot方法检测各组细胞Cx43的表达含量。培养单层细胞,通过对FITC标记的葡聚糖的通透性的检测观察单层细胞的通透性,统计分析Cx43含量与单层细胞通透性的关系。 实验结果: 实验一 体内实验 大鼠吸入海水后,肺组织W/D比值增加,BALF中的蛋白含量和ELI也明显增加(P<0.

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