638%和77 756%(P<0 001);K562-MKK3(Ala)细胞Gγ-mRNA水平下降,为K562-pcDNA3 1细

638%和77.756%(P<0.001);K562-MKK3(Ala)细胞Gγ-mRNA水平下降,为K562-pcDNA3.1细胞的37.996%(P<0.001);SB预处理之后,K562-MKK3(Glu)+SB细胞和K562(NaB)+SB细胞HbF表达下降,分别为K562-MKK3(Glu)细胞和K562(NaB)细胞的51.515%和35.142%(P<0.001);K562-MKK3(Ala)细胞HbF表达下降,为K562-pcDNA3.1细胞的45.144%(P
研究背景

Sorafenib体外 角膜具有透明、无血管、有弹性的特点和较强的屈光能力。正常角膜组织分为上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层;其中上皮层由多层上皮细胞组成,基质层含有角膜细胞,内皮层由单层排列内皮细胞构成。角膜缘含有丰富的血管网,主要供给角膜周边部的养分;房水、泪液等也是养分的重要来源。 在炎症、外伤、免疫损害、微生物感染等病理因素作用下,角膜缘周边血管网逐渐长入透明角膜内,形成角膜新生血管。角膜新生血管在抵御病理损害中具有重要作用,可以促进炎症吸收、角膜修复并改善角膜血供;同时由于大量的免疫效应细胞聚集在角膜,改变了角膜固有的免疫学特征,导致角膜相对免疫赦免机制的消除;降低角膜的透明性,严重影响视力;为角膜疾病的后续治疗带来重大挑战。 深入研究角膜新生血管生长和调控的机制具有重要的意义。研究发现角膜新生血管的影响因素有很多,炎症反应是角膜新生血管的重要影响因素之一。角膜新生血管与炎症反应相互作用、相互依赖、相互协同。角膜炎性细胞浸润通常出现在新生血管之前,角膜炎性浸润部位与新生血管部位一致。炎症反应引起多种炎性介质、细胞因子释放,从而打破促血管生长因子和抑制血管生长因子之间的平衡,最终导致角膜新生血管。 信号转导研究是生命科学的热点和前沿,其基本研究思路已浸染生命科学的各领域。信号转导将为解释生命基本现象、细胞代谢、肿瘤分子机制、病理反应过程以及开发新型药物提供新的思路。丝裂原活化蛋白激酶是一组能被不同细胞外刺激激活的一系列丝氨酸-苏氨酸激酶,可磷酸化其它细胞质蛋白,并从细胞浆移位至细胞核,作用于多种转录因子,从而激活不同基因表达,产生复杂的生物学功能。在哺乳动物,高度保守的丝裂原活化蛋白激酶是信号从细胞外到细胞核传递的重要信使,参与了胚胎发育、细胞分化、细胞增殖、细胞死亡、对环境的应激适应、炎症反应等多种细胞生理及病理反应。

目前共发现了四种丝裂原活化蛋白激酶亚族,分别是细胞外信号调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、p38和ERK5。细胞外信号调节蛋白激酶主要作用于细胞分化、转化和增殖;c-Jun氨基末端激酶参与胚胎发育、细胞分化,并且与肿瘤的发生密切相关:ERK5信号通路参与细胞周期、细胞增殖和早期基因表达的调控;而p38信号通路则在炎症反应中具有重要作用。 p38信号通路的激活是细胞内磷酸化级联反应的最后步骤,磷酸化p38是p38的活化形式。p38激活后立即进入细胞核,激活多种蛋白激酶和转录因子,产生复杂的生物学效应。p38在炎症反应过程中的多效性、高效性,使得p38信号转导通路成为炎症相关疾病研究的新的作用靶点而备受关注。p38成为丝裂原活化蛋白激酶家族中调控炎症反应的最重要成员。 炎症反应与角膜新生血管密切相关,而p38信号转导通路在调控炎症反应中具有重要作用,因此p38信号转导通路可能在角膜新生血管调控中具有重要作用。研究也发现p38抑制剂在炎症相关疾病动物模型中表现出较好的抗炎作用,p38信号转导通路抑制剂SB220025能显著降低肉芽肿组织内血管密度。角膜新生血管研究一直是眼科研究的热点和难点。p38信号通路具有复杂的生物学效应,参与炎症反应过程,调控多种细胞因子的表达,从该通路研究角膜新生血管的机制,必将成为研究的新方向和新靶点。 点击此处 实验中,我们通过检测血管化进程中大鼠角膜磷酸化p38表达,来探讨p38信号转导通路和角膜新生血管的相关性;通过研究p38信号转导通路特异性拮抗剂SB203580对大鼠角膜的毒性作用,来研究其用于阻断信号转导通路的可能性;进一步研究SB203580对大鼠角膜新生血管的抑制作用,探讨p38信号转导通路参与调控角膜新生血管的可能机制;最后通过可溶性血管内皮生长因子受体2试图阻断血管内皮生长因子的作用,进一步检测磷酸化p38的表达,并分析p38信号转导通路和血管内皮生长因子的关系。 第一部分磷酸化p38在大鼠角膜血管化进程中的表达 目的 检测p38和磷酸化p38在大鼠角膜血管化进程中的表达,探讨大鼠角膜新生血管生长是否和p38信号转导通路的激活相关,并进一步分析p38和磷酸化p38在大鼠角膜血管化进程中时间和空间分布特征,拟最终证实p38信号转导通路激活可能与大鼠角膜新生血管相关,p38信号转导通路的早期激活可能是大鼠角膜新生血管的始动因素之一,为进一步研究奠定基础。

方法 1.角膜缝线法建立SD大鼠角膜新生血管模型建立大鼠右眼新生血管模型,在大鼠角膜缘内1mm等间距缝合3针,深及基质层。选取未缝线的正常角膜作为阴性对照组,并将缝线后大鼠随机分为缝线后第1日组,第3日组以及第7日组,每组8只。 2.显微镜下观察角膜缝线后每日在手术显微镜下观察,均放大16倍,注意角膜透明度、上皮完整性、缝线数量以及是否存在角膜感染。 3.计算角膜新生血管面积计算角膜缝线后第1日、第3日以及第7日,分别在显微镜下测量角膜新生血管长度,并依据Robert公式计算角膜新生血管面积。 4. Western Blot检测缝线后角膜血管化进程中p38和磷酸化p38的表达缝线当日以及缝线后第1、3、7日,分别从各组随机选取5只大鼠,摘取角膜,收集角膜蛋白,采用Western Selleck GSK2656157 Blot方法检测各组角膜p38以及磷酸化p38的表达,并检测目的蛋白IOD与内参GAPDH的IOD,二者比值作为目的蛋白的相对表达量。 5.免疫荧光检测p38和磷酸化p38在角膜上的表达按照分组分别在特定时间摘取角膜,采用免疫荧光的方法检测p38和磷酸化p38在角膜的表达以及定位。 6.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示。当方差齐性时,采用one-way ANOVA分析;方差不齐时采用Welch法校正。组间比较,当方差齐性时,采用LSD分析;当方差不齐性时,采用Dunnett T3进行分析。所有统计推断均采用双侧检验,检验水准α=0.05。 结果 1.显微镜下观察缝线后7d,角膜缘血管网充血,缝线处角膜水肿增厚,并随时间延长逐渐加重,缝线后3d,睫状充血明显,角膜缝线处角膜缘明显局限性充血,可见新生血管缓慢长入,每处约2-5支,缝线处角膜未见明显混浊,全角膜透明;缝线后7d,见大量新生血管长入透明角膜,新生血管呈密集网状,无法计数,部分新生血管长到缝线处,缝线处角膜轻度混浊并增厚。 2.角膜新生血管面积缝线后第1日,未发现新生血管;缝线后3、7d,角膜新生血管面积分别为4.1-1.22、7.26±0.72mm2;而正常角膜无新生血管。 3.Western Blot结果 各组角膜p38的相对表达量为:正常角膜组0.5681±0.1074,缝线后第1日组为0.

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