乳腺癌细胞中miR-200c的检测 正常乳腺上皮细胞株MCF-10A,基底型乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT549和管腔型乳

乳腺癌细胞中miR-200c的检测 正常乳腺上皮细胞株MCF-10A,基底型乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT549和管腔型乳腺癌细胞株MCF-7、BT474细胞,依据Trizol Reagent试剂的说明书进行操作,提取细胞总RNA;按照PrimeScript RT reagent Palbociclib体内 kit说明书进行逆转录反应,获得cDNA;以cDNA为模板,采用茎环法依据SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应以检测这5株细胞中miR-200c的表达水平。 2. miR-200c mimic,inhibitor及siRNA和plasmid的转染 采用阳离子脂质体法进行转染,按照lipofectamine2000操作说明进行操作,采用无血清培养基培养细胞,当细胞融合度达到70%左右时,将mimic,inhibitor,siRNA或plasmid稀释于转染专用培养基Opti-MEMI

Reduced Serum Medium中,lipofectamine2000同样用Opti-MEMI Reduced Serum Medium稀释后,与mimic, inhibitor, siRNA或plasmid溶液混合,室温下静置20min后,加入培养板中。继续在培养箱中孵育4-6h后,将培养基换成含有血清的完全培养基,转染完成,48h后提取细胞的RNA或蛋白或进行后续的处理。为有效抑制niR-200c的功能簇,miR-200c inhibitor需与miR-429inhibitor同时转染。 3.细胞辐射及克隆形成实验 细胞经消化制成单细胞悬液后,按照预定数量接种于6孔板中,设0,2,4,6,8五个剂量组,每个剂量组三个复孔。照射后将细胞置于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱内继续培养12-14天,期间根据培养液pH值变化适时更换新鲜培养液。当培养板孔中出现肉眼可见克隆时,终止培养,弃去培养液,PBS清洗细胞2遍,甲醇固定,1%结晶紫乙醇溶液染色,显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数,计算克隆形成率和存活分数,并运用GraphPad

Prism5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合,并计算辐射增敏因子SER10。 4. Western blot实验 处理后的细胞提取总蛋白,按照BCA法测定蛋白浓度,加入5×SDS-PAGE loading Buffer进行蛋白变性,然后经电泳、转膜、封闭后,孵育一抗和二抗,最后采用ECL法在显影仪上进行显影。 5.构建稳定表达GFP-LC3的MDA-MB-231细胞 将5×105/孔的细胞接种于6孔板中,培养12h待细胞密度达40%左右,加入MAP1LC3B和对照LV5-NC慢病毒悬液100μl/孔(MOI=20),并设2孔加入终浓度为6ug/ml的polybrene以增加感染效率,24h后更换培养基,72h后在荧光显微镜下拍照并计算感染效率。随后采用流式细胞仪分选GFP+细胞,以获得比例较高的GFP+细胞扩大培养,得到稳定表达GFP-LC3的细胞。 PLX-4720半抑制浓度 6.生物信息学分析预测miR-200c调节自噬的靶基因 利用三大常用miRNA数据库TargetScan,Pictar和miRBase对miR-200c可能的靶基因进行预测分析,将这三个数据库预测到的结果取交集以提高可信度,然后在基因功能分析网站上查询这些基因的功能,并且在Pubmed里进行检索查询这些靶基因的功能是否与自噬相关。 7.检测乳腺癌细胞中miR-200c过表达后UBQLN1的表达 在乳腺癌细胞中通过转染miR-200c mimic或scramble negative control后,通过荧光定量PCR和Western blot检测细胞中miR-200c过表达后UBQLN1的mRNA和蛋白的表达变化。

8.双荧光素酶报告基因检测法验证miR-200c的靶基因 依据阳离子脂质体法将包含miR-200c假定结合位点的UBQLN13′UTR以及突变型UBQLN1的3′UTR的萤光素酶报告质粒和]miR-200c或scramble negative control共同转染乳腺癌细胞。转染完成48h后,依据Promega公司的Dual-Luciferase报告基因检测系统进行样本的萤光素酶活性检测,按照试剂盒说明书进行操作,以萤火虫萤光素酶的活性作为内参,依据海肾萤光/萤火虫萤光的比值(Renilla/Firefly)分析miR-200c抑制UBQLN1的效果。 那个 9.恢复实验证实UBQLN1是miR-200c的功能性靶基因 依据阳离子脂质体法将miR-200c mimic和CMV-UBQLN1plasmid共转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。转染完成48h后,Western blot检测转染效率,并进行克隆形成实验检测细胞辐射敏感性的变化,Western blot检测辐射后细胞自噬活性的改变。 10.乳腺癌组织中UBQLN1和LC3的检测 收集乳腺癌组织及瘤周正常组织标本35例,经病理确诊全为浸润性乳腺癌,经4%多聚甲醛固定、包埋、切片后进行免疫组化染色检测组织中UBQLN1和LC3的表达水平。 11.乳腺癌组织中miR-200c的检测 上述乳腺癌组织及瘤周正常组织标本,采用原位杂交的方法检测组织中miR-200c的表达水平。 12.统计分析 采用SPSS13.

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