49±0 45 μmol/L和25 4±1 1pmol/min/mg protein;NC在MDCK-hOCT1/MDCK-hOC

49±0.45 μmol/L和25.4±1.1pmol/min/mg protein;NC在MDCK-hOCT1/MDCK-hOCT3细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC50值分别为0.163±0.027 μmol/L和0.522±0.072

μmol/L。而在mock细胞上IC50值为17.0 ±4.2 μmol/L。OCT1/3抑制剂(+)/(-)-THP均能显著降低NC的细胞毒性;经0.5μmol/L NC处理,MDCK-hOCT1和MDCK-hOCT3细胞存活率分别降低至空白对照组的17.5±4.7%和55.4±3.8%,50μmol/L的(+)/(-)-THP使MDCK-hOCT1细胞存活率分别升高至对照组的45.6±1.2%和51.6±2%,使MDCK-hOCT3细胞存活率升高至对照组的89.1±5.3%和86.1±7.0%。在大鼠原代肝细胞模型上也观察到(+)/(-)-THP对NC诱发的肝细胞毒性的减弱作用。NC在MDCK-hMATE1细胞上的积聚显著高于mock细胞,其Km、Vmax及Clint分别为0.897±0.085 因为 nmol/L,18.5±1.0 pmol/mg protein/min,为20.6mL/mg protein/min。然而,MATE1对NC的转运能力(Clint:20.6 mL/mg protein/min)明显低于OCT1(Clint:311 mL/mg protein/min)。结论:OCT1,OCT3通过介导NC的细胞摄取,在其致肝细胞毒性中发挥重要作用;(+)/(-)-THP通过抑制OCT1,OCT3介导的细胞摄取而减弱NC的肝细胞毒性。MATE1对NC的转运能力低于OCT1,推测肝细胞中由hOCT1和hOCT3介导的NC摄取大于hMATE1介导的外排。第三章CYP450对Nitidine的代谢解毒作用背景和目的:第二章实验结果显示,NC在大鼠原代肝细胞上的毒性明显低于稳定高表达OCTs的MDCK细胞上的毒性,我们推测原代肝细胞中OCTs表达可能低于稳定转染细胞,推测原代肝细胞中P450酶(CYP450)可能介导NC代谢,从而降低NC的细胞毒性。因此,本章研究CYP酶对NC的代谢及在其肝细胞毒性中的作用。方法:应用人肝微粒体代谢酶表征实验和人重组酶验证,阐明参与NC肝脏代谢的主要CYP酶亚型;比较NC对MDCK-hOCT1细胞及hOCT1与hCYP3A4双转细胞(MDCK-hOCT1/hCYP3A4)的毒性差异,以及CYP3A4抑制剂对NC致MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞毒性的影响,阐明CYP酶对NC的代谢解毒作用。结果:CYP3A4,

Pifithrin-α半抑制浓度 CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的肝脏代谢。NC (0.25-10 μmol/L)对MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞的毒性明显低于对MDCK-hOCT1细胞的毒性;CYP3A4抑制剂,氟康唑和红霉素,显著增强NC在MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞上的毒性,提示CYP3A4通过介导NC代谢而减弱NC的毒性。结论:肝脏CYP3A4, CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的一相代谢;CYPs,如CYP3A4,可通过介导NC的肝脏代谢而降低其肝细胞毒性。第四章Nitidine在大鼠体内的药动学和组织分布研究背景和目的:前述研究考察NC在转基因细胞模型及原代肝细胞模型上的摄取及细胞毒性,本章主要考察单次口服和尾静脉注射后,NC在大鼠体内的药动学过程,并计算其口服生物利用度,以推测口服给予NC后在体内是否会引起毒性。同时考察单次及连续20天静脉注射NC

(5mg/kg)后,其在大鼠体内的组织分布,以阐明NC分布的组织特异性及连续给药可能由OCTs介导NC细胞摄取发生的组织蓄积现象,为NC的体内毒性提供药动学依据。方法:建立快速、准确、灵敏的LC-MS/MS法测定生物样本中的NC,并将此方法用于测定大鼠口服10mg/kg或尾静脉注射2 mg/kgNC后的血浆药物浓度,计算其口服生物利用度;比较单次静脉注射5 mg/kg NC与相同剂量连续给药20天后相应组织的分布差异。结果:大鼠口服10 mg/kg NC后,血药浓度低,其绝对生物利用度仅为4.8%。鉴于口服NC的生物利用度低,本章考察了大鼠单次静脉注射5 mg/kg NC后的组织分布,结果显示,给药后0.25 h、0.5 h及2h,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度远远高于其在血浆中的浓度,组织与血浆的浓度比值为9.2-2852;以5mg/kg/day的剂量连续静注20天,末次给药后2h,心脏、肝脏、肾脏及小肠中NC的浓度均高于单次给药后相应组织中的浓度。结论:NC的口服生物利用度低,推测其口服后产生毒性的可能性较小。单次静脉注射NC后,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度高于其在血浆中的浓度。因此,推测大鼠连续静注NC,可能会产生组织蓄积而引起一定的毒性。第五章Nitidine连续给药后大鼠体内的毒性研究背景和目的:前几章研究显示,由于肝脏细胞中OCT1/3介导NC的细胞摄取,导致NC较强的肝细胞毒性。但NC经口给药后绝对生物利用度低,而静脉注射后组织分布研究表明,NC在不少组织中的浓度显著高于血浆中浓度,且连续给药后,在大鼠肝脏、肾脏及心脏等脏器存在蓄积现象,提示连续给药NC在大鼠体内可能引起脏器毒性或整体毒性。因此,本章考察大鼠连续静脉注射NC后的毒性,为NC的研发提供参考。方法:Sprague-Dawley大鼠连续20天静脉注射5 mg/kg/day NC,观察其一般活动行为、体重、检测血清生化指标,组织病理学检查,综合评价NC在体内的整体毒性。以MDCK-hOCT2和mock细胞为模型,采用MTT法及检测细胞培养液中LDH活性的方法,对hOCT2介导的NC细胞毒性以及OCT2抑制剂,(+)/(-)-THP和西咪替丁,对其细胞毒性的减弱作用进行考察。结果:NC可引起大鼠食欲减退,体重减轻,血清LDH值和BUN值明显升高,分别为给药前的2.1倍和1.4倍,ALP值显著降低至给药前的1/5,且组织病理学检查观察到肾小管产生空泡变性,未发现NC在大鼠体内对其它受检脏器引起毒性。此外,NC在MDCK-hOCT2细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC5o值分别为0.556±0.083 μmol/L及17.0 ±4.

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