00mg/L)培养基RPMI-1640。D组:为转染shRNA质粒干扰+胃泌素组,4-6小时后换含胃泌素(25 00mg/L)培养

00mg/L)培养基RPMI-1640。D组:为转染shRNA质粒干扰+胃泌素组,4-6小时后换含胃泌素(25.00mg/L)培养基RPMI-1640,再培养24h。由上海吉凯基因构建p38MAPK-shRNA,转染后观察转染效率,当转染效率达到30%或以上。接着使用流式细胞仪各组细胞增殖;再用Westernblot法检测各组细胞中P38蛋白的表达水平。

ABT-263细胞系 结果: SW480细胞中存在CCKBR mRNA表达。胃泌素在6.25~200.00mg/L范围内能抑制大肠癌SW480细胞的凋亡,且当浓度达25.00mg/L时为最佳浓度(P<0.05)。转染24小时后,观察荧光表达的细胞得出转染效率,当质粒与脂质体的质量比为1:2时转染效率为40%-50%之间。质粒干扰+胃泌素组(D组)细胞增殖指数为(26.47±1.24)%,显著高于空白对照组(A组)的(24.34±0.67)%和阴性干扰组(B组)的(24.18±1.43)%(P<0.05),胃泌素组(C组)细胞增殖指数为(26.39±1.15)%,显著高于空白对照组(A组)和阴性干扰组(B组)(P0.05),空白对照组(A组)和阴性干扰组(B组)比较也无明显差异。利用Western-blot检测四组p38蛋白表达水平存在差异(P<0.01)。在胃泌素组(C组)和质粒干扰+胃泌素组(D组)中表达水平低于空白对照组(A组)(P<0.01),也低于阴性干扰组(B组)(P0.05),胃泌素组(C组)和质粒干扰+胃泌素组(D组)之间的蛋白差异无统计学意义(P>0.05)。 结论:胃泌素能够促进体外大肠癌SW480细胞增殖,同时p38蛋白的表达明显降低,而通过质粒干扰p38蛋白的表达后,大肠细胞SW480的增殖明显增强。进一步论证了胃泌素通过p38信号通路实现对大肠癌细胞SW480的生长调控。
目的研究在炎症因子肿瘤坏死因子-α Selumetinib molecular weight (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)刺激下施万细胞中β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ(β-1,4-Galactosyltransferase Ⅰ,β-1,4-GalT Ⅰ)的表达改变,探讨其在TNF-α自分泌、细胞增殖及凋亡中的作用及其机制。 方法 1.为了研究β-1,4-GalT Ⅰ在施万细胞TNF-α自分泌中的作用,运用50ng/mL重组的大鼠TNF-α刺激体外培养及纯化的大鼠施万细胞,运用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,

ELISA)检测施万细胞TNF-α自分泌的改变,逆转录-多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及Western blot检测TNF-α诱导β-1,4-GalT Ⅰ的表达及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK)和p38信号转导通路的激活情况,同时用中和性抗体阻断TNFR1/2的功能,检测其对TNF-α诱导的β-1,4-GalT Ⅰ表达及TNF-α自分泌的影响;在此基础上在施万细胞中分别转染β-1,4-GalT Ⅰ干扰及过表达质粒,分析干预β-1,4-GalT Ⅰ的表达对施万细胞ERK、JNK和p38信号转导通路激活及其介导的TNF-α自分泌的影响。 2.为了探讨β-1,4-GalT

Ⅰ在TNF-α诱导的施万细胞增殖及凋亡中的作用,运用不同溶度(0、0.001、0.01、0.1、1、10及100ng/mL)的重组大鼠TNF-α处理施万细胞,运用MTT分析法,分析施万细胞增殖的情况,运用TUNEL分析法,分析施万细胞凋亡的情况,利用Western blot,检测不同溶度TNF-α诱导β-1,4-GalT Lenvatinib Ⅰ及TNFR1/2的表达变化。在此基础上,利用基因转染方法增加或减少β-1,4-GalT Ⅰ在施万细胞中的表达,检测ERK1/2、p38与JNK活性及施万细胞增殖和凋亡的改变:同时运用中和抗体干预TNFR1/2的功能,分析介导上述效应的改变。 结果 1.施万细胞在50ng/mL重组的大鼠TNF-α刺激24h后,细胞内TNF-α的mRNA水平及培养基中自分泌的TNF-α含量较未处理组明显升高,RT-PCR及Western blot发现胞内β-1,4-GalT Ⅰ的mRNA及蛋白表达水平显著增加。干扰施万细胞中β-1,4-GalT Ⅰ的表达,TNF-α的自分泌较未干扰组显著降低,而过表达β-1,4-GalT Ⅰ后,施万细胞内TNF-α的自分泌显著提高。运用中和抗体阻断TNFR的功能,发现阻断TNFR1可以逆转TNF-α诱导的β-1,4-GalT Ⅰ的表达及TNF-α的自分泌。Western blot显示,TNF-α可以诱导ERK、JNK和p38信号通路的活化,抑制ERK、JNK和p38可以有效地抑制TNF-α的自分泌。干扰β-1,4-GalT Ⅰ的表达可以抑制TNF-α诱导的ERK、JNK和p38信号通路的活化,而过表达β-1,4-GalTⅠ后,TNF-α自分泌显著增加,但可以被ERK、JNK和p38的抑制剂PD98059、SP600125和SB202190所抑制。 2.MTT法测定细胞增殖表明用不同浓度的TNF-α处理施万细胞12h后,在0.

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