雄性生殖干细胞(mGSCs)，也称作精原干细胞(SSCs)，是近年来发育生物学最具有吸引力的研究热点之一，雄性生殖干细胞的研究在生物医学、畜牧生产等领域都具有广泛的应用前景。奶山羊雄性生殖干细胞主要定位于睾丸曲细精管基底膜,是奶山羊睾丸内精子发生的基础，精子生成于睾丸的曲细精管内。雄性生殖干细胞的减数分裂受许多基因的精确时序调控。目前，IKK inhibitor,已发现了一些基因会促进小鼠生殖细胞减数分裂的起始，但是关于奶山羊雄性生殖干细胞减数分裂的研究还较少，相关机理还很不清楚。 本研究检测了不同时期奶山羊睾丸组织中Boule、Stra8、P53和miR-34c的表达情况，对分离纯化得到的奶山羊mGSCs进行生殖细胞及多能性细胞标志基因和蛋白表达的检测。随后通过在奶山羊mGSCs上过表达相关基因，并对减数分裂其它相关基因进行检测来确定它们之间是否存在调控关系。我们在奶山羊mGSCs上发现的相关信号途径有：（1）Boule可以直接调控Stra8的表达并促进其转录和翻译，进而可能促进减数分裂的进行；（2）过表达P53可以激活miR-34c的表达，miR-34c表达是P53依赖性的；（3）过表达Boule和Stra8可以上调miR-34c的表达，但不是通过P53引起的。 1.Boule促进mGSCs的减数分裂 Boule是减数分裂过程中一个相对保守的基因，它编码的RNA结合蛋白是精母细胞进行减数分裂所必需的。Integrase 抑制剂,BOULE蛋白的缺失会阻滞精子发生过程中减数分裂的启动进而造成不育。至今为止，Boule在奶山羊睾丸组织中的表达规律和功能均不清楚。实验证实Boule在成年奶山羊睾丸组织中表达量明显高于青春期、胎羊以及间性羊和无精羊。在mGSCs上过表达Boule48h后，减数分裂相关基因的表达也明显上调，Stra8上调最为明显，通过Western-blot和荧光素酶报告基因载体技术，进一步证实Boule可以直接作用于Stra8并上调其表达。同时我们在奶山羊mGSCs上过表达Boule的下游基因Cdc25A，并未检测到Stra8表达水平有明显改变，而RA可以诱导Boule和Stra8的表达。结果证实Boule在奶山羊精子发生过程中发挥着重要的功能，过表达Boule可以促进奶山羊的减数分裂和精子发生。 2.miR-34c受P53调控并促进mGSCs的凋亡 MicroRNA(miRNA)是一类对基因进行转录后调控的非编码小RNA。已有的证据表明miRNAs在一系列生物学过程发挥重要功能，然而miR-34c在雄性生殖干细胞的研究比较少。我们将miR-34c模拟物和抑制剂转染mGSCs，通过形态学观察、Brdu染色、流式细胞术、Q-RT-PCR和Western-blot等检测发现miR-34c可以促进mGSCs的凋亡，降低其增殖能力，并阻滞细胞周期。Mdm2 inhibitor,在mGSCs中过表达P53也可以发现miR-34c的表达有明显上调。因此，我们得出结论：miR-34c可以促进mGSCs的凋亡并降低其增殖能力，并且miR-34c是依赖P53调控的。 3.mGSCs中过表达Boule和Stra8不通过P53上调miR-34c的表达 生殖是所有动物赖以生存的基础，精子发生是完成繁殖所必须经历的过程，精子发生是一个复杂的发育过程其最终目的是源源不断的产生单倍体精子。当前研究已表明：Boule和Stra8在雄性生殖细胞的减数分裂起始过程中发挥重要作用，而miR-34c是精子发生过程后期完成所必不可少的miRNA，但是其主要功能是促进多种细胞凋亡。我们发现过表达Boule和Stra8可以上调miR-34c的表达，在我们先前研究已证实miR-34c是P53依赖性的，所以我们进一步探索Boule和Stra8造成的miR-34c的上调是不是通过P53引起的，发现过表达Boule和Stra8后，细胞的增殖能力变化不大，同时P53在mRNA和蛋白水平的表达也无明显改变，所以Boule和Stra8上调miR-34c可能是促进mGSCs减数分裂造成的。

有研究显示,miRNA参与肿瘤的进展,然而下调的miRNA在肿瘤进展中的作用一直不明确。基于此,本课题主要研究miR-218在骨肉瘤进展中的作用。我们首先检测了骨肉瘤组织、癌旁组织以及人类骨肉瘤细胞系Saos-2细胞中miR-218的表达,SB202190，然后对miRNA218在骨肉瘤细胞中的作用进行了深入的研究。将miR-218表达载体转染入Saos-2细胞后,我们分别用ATPlite的实验方法检测了细胞的增殖变化,细胞划痕实验检测了细胞的迁移能力,transwell实验检测了细胞的侵袭能力。我们进一步预测和证实了miR-218作用的靶基因。结果显示,Saos-2细胞转染了miR-218表达载体后,其增殖能力、迁移和侵袭能力明显被抑制。Westernblotting结果表明miR-218的表达可以抑制T-细胞淋巴瘤侵袭和转移因子1(TIAM1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)和9(MMP9)从而确定了miR-218作用的靶基因为TIAM1、MMP2和MMP9。以上结果提示miR-218可以通过下调骨肉瘤细胞中TIAM1、MMP2和MMP9的表达发挥抗肿瘤的作用。Abexinostat， 通过AnnexinV及PI的染色分析发现miR-218本身并不能促进Saos-2细胞的凋亡,但有趣的是miR-218可增加Saos-2细胞对化疗药物多柔比星的敏感性,可以增强多柔比星的肿瘤细胞杀伤作用。最关键的体内实验同样证实,miR-218高表达的Saos-2细胞的生长被明显抑制,其荷瘤小鼠的生存率显著高于野生型Saos-2及空载体转染的Saos-2细胞荷瘤小鼠。同时还发现,经多柔比星处理后,其抗瘤效果更加显著。说明miR-218不仅本身对Saos-2肿瘤的生长具有抑制作用,且同时增加Saos-2细胞对化疗药物多柔比星的敏感性,与化疗药物具有协同抑制肿瘤生长的作用。 结果 非CAD组患者血浆HDL-C明显高丁CAD组,男性比例明显低于CAD组,血糖异常比例明显低于CAD组；PCI-24781，UAP组患者冠脉病变程度明显重于SAP组；非CAD组、SAP组、UAP组患者血浆GDF-15水平依次升高：血浆GDF-15水平与年龄、血糖异常、冠脉病变程度呈显著正相关。BMI、HGB、GDF-15水平与入院行冠脉造影检查的非心梗患者的预后独立相关；冠脉病变程度与CAD患者一年预后独立相关；非CAD患者血浆GDF-15水平大于1200ng/L组预后较差；血糖异常进展者基础GDF-15水平高：GDF-15水平大于900ng/L的CAD患者接受介入治疗可明显获益。 结论 GDF-15与传统心血管危险因素和冠脉病变程度相关,其水平升高提示患者无终点事件生存率低并更容易进展为血糖异常,GDF-15可作为心血管疾病危险分层的生物标记物指导CAD患者的治疗选择。

背景骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,来源于间叶组织,可发生于任何年龄,尤其好发于青少年,预后差。骨肉瘤恶性程度及转移率高,其远处转移是大多数骨肉瘤患者治疗失败和死亡的最主要原因。从目前情况来看,虽然5年生存率已经达到65-75%,但在诊断、治疗和预后等方面仍存在不足。为此,发现并建立新的、有效的骨肉瘤的诊治措施势在必行,探索早期诊断、预后评判标准和开发新的治疗药物(非化疗药)是当前骨肉瘤临床诊治中热门的研究方向。文献表明,BMI-1基因在肿瘤方面的研究证据非常丰富。但目前国内、外对于该基因与骨肿瘤的相关性研究却较为缺乏,因此我们将研究重点锁定在BMI-1与骨肉瘤之间的相关性研究上。 目的构建人BMI-1基因相关shRNA慢病毒载体,包装成病毒颗粒后感染骨肉瘤细胞株后,观察抑制BMI-1表达水平对肿瘤细胞增殖、侵袭能力、细胞周期以及对化疗药物敏感性的影响。并通过回顾性研究探讨BMI-1在骨肉瘤细胞中的表达及其与临床病理及预后的关系。 方法用慢病毒介导的BMI-1shRNA转染人骨肉瘤细胞株SAOS-2和U20S,并通过Real-timePCR和WesternBlot检测转染后BMI-1的表达情况。运用MMT实验、PI-FACS实验、平板克隆实验、Tanswell细胞侵袭实验、流式双染实验对转染后的人骨肉瘤细胞株的恶性表型进行检测。同时对北京协和医院的16例骨肉瘤、9例软骨肉瘤、11例骨软骨瘤、2例尤文氏肉瘤进行免疫组化实验,临床验证BMI-1与骨肉瘤的关系。 结果慢病毒介导的RNAi持续的、显著的降低了BMI-1表达。PHA-665752，在体外实验中,下调BMI-1表达显著影响了人骨肉瘤细胞的恶性表型,降低了增殖能力、侵袭能力,增加了对于顺铂化疗的敏感性,但对于细胞周期无显著性影响,并通过回复对照实验证实该基因的特异性,同时发现BMI-1RNAi对肿瘤细胞的增殖、侵袭抑制作用及增加肿瘤细胞对顺铂化疗敏感性具有一定的细胞特异性。临床病例研究证实BMI-1存在于骨肉瘤(12/16)、骨软骨瘤(1/11),软骨肉瘤(6/9)、尤文氏肉瘤(1/2)中,但在非肿瘤骨组织中没有表达(0/10)。骨肉瘤中BMI-1阳性表达率显著高于骨软骨瘤及非肿瘤骨组织(P

p53作为一个重要的抑癌基因,一方面调控着促进细胞凋亡的过程,另一方面通过调控细胞周期从而调节应激条件下细胞修复机制。在很多肿瘤细胞中都伴随着热休克蛋白27(Hsp27)的高表达,它是热休克蛋白家族中可以被磷酸化修饰的小热休克蛋白的典型代表。Hsp27调节p53蛋白水平和其激活已有报道,但对于涉及Hsp27磷酸化修饰在此过程中作用的研究并不系统和完整。BAY 73-4506,本课题就Hsp27及其磷酸化形式对于p53蛋白的调控,下游信号的激活和相关信号通路等都做了较为深入和系统的研究。 首先,本研究发现Hsp27参与了调节p53蛋白稳定性和激活的过程。在人胚肾细胞株HEK293A细胞中的研究发现,Hsp27能下调外源性p53引起的p21转录激活,并且抑制了由此引起的细胞周期阻滞。在细胞内通过瞬时转染过表达外源性Hsp27发现Hsp27可以显著增强p53的泛素化,但是却对p53下游的MDM2的表达呈现剂量效应的抑制作用。通过对于p53下游p21,MDM2的抑制和对p53本身泛素化的促进,表明Hsp27对p53具有负向调控的功能,LY335979,从而缓解由于p53引起的细胞周期阻滞。 Hsp27是一种可以被磷酸化修饰的小热休克蛋白,其磷酸化和非磷酸化形式均在细胞的增殖、凋亡、分化、炎症等多种生理病理过程中发挥了不同的生物学功能。在本文中,我们发现并报道了磷酸化的Hsp27发挥着与非磷酸化的Hsp27不同的作用：1)过表达磷酸化Hsp27突变体(Hsp27-3D)促进了p53的激活,但是长时间作用后促进了p53的下调；2)过表达Hsp27-3D促进了p53的核聚集,而过表达非磷酸化Hsp27突变体(Hsp27-3A)并没有表现出这种p53趋核聚集的现象,相反的出现了出核增加的趋势；3)磷酸化的Hsp27促进了ATM的激活,从而增强了p53/p21信号级联反应。这些结果都表明Hsp27磷酸化后对于p53的激活发挥了重要的作用。 多柔比星(Dox)是一种常用的DNA毒抗癌药物,容易在细胞核内聚集并导致细胞凋亡。在最后一部分中,Ganetespib,我们发现亚致死剂量的Dox可以引起具有野生型p53的乳腺癌细胞MCF-7中Hsp27,ATM和p53的磷酸化,磷酸化后的Hsp27增加了与ATM,p53形成三元复合物的水平,从而引起p21的积累。而当使用多种手段抑制Hsp27磷酸化后,ATM和p53磷酸化也同时被抑制,进而阻断了p21蛋白水平的上调和其介导的细胞保护作用,引起细胞凋亡的增加。这些结果表明磷酸化的Hsp27通过增加与ATM的结合从而激活p53,通过p53/p21通路对细胞进行保护性调节。 综上所述,本研究首次揭示了Hsp27磷酸化形式对于p53激活和蛋白水平的调控作用；提出了Hsp27在胞内发挥保护作用的新的作用机制。这些结果对深入研究Hsp27在细胞周期,肿瘤耐受等多种生理病理条件下的调节作用具有重要的指导意义。

目的：在前两部分的研究中,我们发现了两个RARα泛素化降解过程的可能调控因子,而蛋白质依赖于泛素蛋白酶体通路的降解是一个由多种酶介导的复杂而有序的分子过程。其中泛素E3连接酶在整个过程中起着中心调节作用,其通过特异性地识别靶蛋白决定着整个过程的精确性。Fostamatinib,因此寻找RARα泛素化过程的泛素E3连接酶对于更好地理解RARα泛素化降解过程的调控具有积极的推动作用。在前期能与RARα结合的蛋白的筛选过程中,我们发现了MDM2这一细胞内重要的泛素E3连接酶,因此本部分的研究我们将在确定MDM2能够促进RARα泛素化降解的基础上致力于探讨MDM2是否可能为RARa的泛素E3连接酶。 方法与结果：我们在U20S细胞中采用ATRA作用后,细胞内RARcα蛋白发生时间依赖性下调。同时我们发现出核抑制剂LMB能够显著逆转ATRA引起的RARa蛋白下调,即ATRA诱导的RARa泛素化降解发生于细胞质中。Westernblotting及免疫荧光实验则证实,ATRA短时间处理U2OS细胞后,细胞内MDM2蛋白发生上调,并在细胞质中累积,这一结果提示MDM2可能与ATRA触发的RARa泛素化降解有关。为了深入研究这一作用,我们在U2OS细胞中过表达了MDM2蛋白,Westernblotting结果显示,MDM2依赖于其泛素连接酶活性促进RARα蛋白下调,而这一作用在ATRA处理后更甚。同时我们构建了MDM2稳定低表达的U20S细胞株,并对其中RARα蛋白水平进行了检测。结果表明,MDM2低表达上调了RARcα蛋白水平,并增强了其蛋白稳定性。进一步研究显示,MDM2高表达促进了ATRA引起的RARα多聚泛素化水平,而低表达则反之。同时体外泛素化实验证实,MDM2的泛素连接酶活性在RARα的多聚泛素化过程中是不可或缺的。SB-715992,另一方面,我们采用免疫荧光技术发现内、外源性的MDM2及RARα均存在一定的共定位,免疫沉淀结果则进一步证实MDM2能与RARα发生相互结合,并且ATRA能够促进两者的结合。在此基础上,采用免疫沉淀技术我们发现MDM2蛋白上第1-109位氨基酸所在的结构域为RARcα蛋白的结合位点,而同样能够结合于MDM2蛋白该结构域的小分子化合物Nutlin-3则能显著干扰MDM2-RARα的结合。同时,Westernblotting结果证实,缺失RARα结合结构域的MDM2蛋白不能促进RARα的下调,而Nutlin-3则能够显著逆转ATRA引起的RARα蛋白下调,提示MDM2促进RARα泛素化降解的作用依赖于与RARcα蛋白的相互结合。R406,基于MDM2对RARα蛋白的负性调控,我们对MDM2在ATRA诱导的U20S细胞分化过程中的作用进行了研究。结果表明,高表达MDM2抑制了ATRA引起的U2OS细胞生长抑制.OPN、RUNX2、ALP等分化标记蛋白的上调及细胞内ALP活性的增加,即过表达MDM2抑制ATRA诱导的U2OS细胞分化,而低表达MDM2则相反。同时,MDM2泛素连接酶活性抑制剂HLI373被发现能够显著上调RARα蛋白,降低其由ATRA引起的多聚泛素化水平,并协同ATRA增强U2OS及原代骨肉瘤细胞的分化水平。 结论：MDM2通过与RARα蛋白的结合并依赖于泛素连接酶活性介导RARα的泛素化降解,可能为RARα的泛素E3连接酶。

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一,并已成为我国城市居民的第一死因。研究表明,p53基因是与人类恶性肿瘤相关性最高的肿瘤抑制因子之一可通过DNA修复、细胞周期阻滞和凋亡等方式发挥抑制肿瘤作用。而癌基因MDM2的表达产物MDM2蛋白可与p53蛋白结合,SCH727965,调控p53的转录活性和稳定性,抑制p53正常的生物学功能,从而促进肿瘤的发生和发展。大量研究表明,阻断p53-MDM2相互作用可引起p53的聚集和激活,促使肿瘤细胞生长阻滞或凋亡,是一种有效的癌症治疗策略。近年来,小分子p53-MDM2结合抑制剂由于其在肿瘤治疗方面的潜在应用前景而备受关注。 为寻找全新母核结构的p53-MDM2结合抑制剂,本论文利用计算机辅助药物设计方法构建了p53-MDM2结合抑制剂的三维药效团和分子对接模型,利用此模型对Maybridge数据库和本实验室化合物库进行虚拟筛选,获得了具良好生物活性的3,4,5-三取代氨基噻吩衍生物MCL0527。MK0683,在此基础上,根据其结构特征,结合骨架迁越、电子等排等理性药物设计方法对MCL0527进行结构优化,设计合成了76个3,4,5-三取代氨基噻吩类衍生物和类似物。所得化合物的p53-MDM2结合抑制活性及体外肿瘤细胞增殖抑制活性测试结果表明：大部分化合物表现出中等到强的p53-MDM2结合抑制活性(ki:0.086～17.66μM)；多数化合物同时对表达野生型p53的A549和HCT116细胞具有中等到强的增殖抑制活性(A549IC50:0.25～22.05μM;HCT116IC50:0.24～35.54μM),并对表达野生型p53的细胞株具有良好的选择性,部分化合物的增殖抑制活性和选择性优于阳性对照Nutlin-3.根据活性测试结果,进行了初步构效关系讨论。代表性化合物(1-55)的体内抗肿瘤活性测试(300mg/kg,ig,qd,21天)结果显示,其对裸小鼠人肺癌A549移植瘤有显著的生长抑制作用,抑制率为59.7%,受试动物体重未见明显下降,提示该化合物具有进一步研究的价值,有成为新型抗肿瘤化合物的潜力。化合物1-51的小鼠全血中代谢稳定性测试结果表明,其在血液中稳定,为该类化合物的后续深入代谢研究奠定了基础。 以前一章节研究过程中发现的活性较好的3,4,5-三取代氨基吡咯类衍生物为基础,根据最低能量构象叠合分析、合理药物设计原理及初步生物活性评价,获得并确定了先导分子1,2,5-三芳基吡咯羧酸类化合物2-39。在此基础上,采用生物电子等排和类似物设计等方法,BAY 73-4506,进而设计合成了26个1,2,5-三芳基吡咯羧酸衍生物。p53-MDM2结合抑制活性测试结果显示,大部分化合物表现出纳摩尔数量级的抑制活性,4个化合物的结合抑制活性优于阳性对照Nutlin-3。其中,化合物2-53(Ki=0.019μM)的活性较Nutlin-3(Ki=0.055μM)提高了2倍,较先导化合物2-39(Ki=1.48μM)提高了77倍。总结初步构效关系：①吡咯环1-苯基上取代基及取代位置的影响：间位取代者的活性总体优于对位取代；取代基为氯、溴或三氟甲基时活性基本相当；邻位引入氟原子有利于提高活性；②吡咯环2-苯基上取代基及取代位置的影响：间氯取代者的活性优于对氯取代；对位引入氟原子可保持或提高活性；③以其它芳环替代5位苯环活性基本保持；④3-羧基衍生化对活性影响较大,可导致活性降低甚至消失。体外肿瘤细胞增殖抑制活性测试结果表明,大部分化合物对表达野生型p53的A549和HCT166细胞具有中等的增殖抑制活性,部分化合物对野生型p53细胞株具有一定的选择性,与Nutlin-3基本相当。在活性筛选的基础上,开展代表性化合物2-53与MDM2的分子对接研究,阐明该类化合物与MDM2蛋白可能的相互作用模式；采用最低能量构象比较分析方法解释了2-53具有强p53-MDM2结合抑制活性的原因,为进一步药物设计提供有利依据。此外,计算机辅助的1,2,5-三芳基吡咯羧酸类衍生物类药性质评价结果表明,该类化合物在体内具有较好的ADME’性质,为后续深入的ADMET’性质研究奠定了基础。

乳腺癌是目前为止女性中发病率最高的肿瘤，早在2002年世界卫生组织就统计出1.15亿的乳腺癌患者。在中国，乳腺癌的发病率以每年3%到4%的速度增加。尽管人们在乳腺癌的分子机制和早期诊断方面已有不小的进步，GDC-0199,但是仍有30%的早期乳腺癌病人经治疗后出现复发。寻找新的乳腺癌诊治的靶点是目前亟待解决的问题之一。干扰素调节因子-4结合蛋白(Interferonregulatoryfactor4-bindingprotein,IBP)作为鸟苷酸交换因子家族分子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF),在免疫系统中具有重要作用：参与免疫突触的形成，与Th2细胞极化相关，等等。2009年我实验室首次发现IBP在正常乳腺上皮中不表达，而高表达于肿瘤上皮中，并发现其与乳腺癌的分级分期、转移等相关。这提示IBP的转录调控机制可能与乳腺癌的发生、发展相关，同时提示IBP在乳腺癌中可能具有新的更为重要的功能。然而，目前关于IBP的转录调控机制尚不十分清楚，IBP在乳腺癌中的信号调节网络以及分子功能还有待进一步研究。 本课题对IBP在乳腺癌中的异常表达的转录调控机制进行了研究，BTK inhibitor,并通过体外实验初步探讨了IBP在乳腺癌治疗中的意义及其相关机制，研究主要从以下几个方面进行： 1.人IBP基因启动子的生物信息学预测及活性分析 (1)将不同长度的IBP5′侧翼序列分别克隆入萤光素酶表达载体，并转染HEK293细胞，利用报告基因检测系统，证实IBP核心启动子区域位于-294到-115的区域。 (2)利用PROMO程序生物信息学分析发现，在该核心启动子区域具有一个潜在的非经典的p53结合位点。 2.野生型p53蛋白对IBP启动子活性及其表达的调控作用 (1)将含有预测p53结合位点的并具有最强转录活性的IBP启动子报告基因质粒(pIV)，分别转染HCT116p53-/-和HCT116p53+/+(野生型p53表达)细胞株，发现在p53缺失的HCT116细胞中该片段具有更强的启动子活性。 (2)将pIV转染p53抑制的乳腺癌细胞株MCF-7及其对照细胞株，发现内源性p53抑制后IBP的启动子活性增强。 (3)利用p53激活剂阿霉素刺激MCF-7细胞，并检测转染的pIV活性，结果阿霉素可以降低IBP的启动子活性。 (4)p53真核表达质粒及其突变质粒p53R175H分别与pIV共转染HCT116p53-/-，结果表明野生型p53调节IBP启动子的活性，而p53R175H不影响IBP启动子活性。 (5)将p53腺病毒感染HCT116p53-/-细胞，并分别转染IBP启动子报告基因质粒及p53结合位点突变的报告基因质粒，c-Met inhibitor,结果表明p53通过预测的p53结合位点调节IBP启动子活性。 (6)分别利用定量PCR和WesternBlot检测p53腺病毒感染、p53干扰慢病毒感染以及p53抑制剂pifithrin-α、激活剂Nutlin-3刺激的MCF-7细胞中IBP的表达情况，结果表明乳腺癌细胞株中IBP表达与p53表达直接相关，IBP是p53的应答基因。 3.体内外实验鉴定野生型p53蛋白与IBP启动子的结合 (1)细胞外，采用MCF-7、HCT116p53+/+和HCT116p53-/-核蛋白，利用电泳迁移率转变实验(electrophoresismobilityshiftassay,EMSA)，结合p21探针竞争实验以及p53抗体超位移实验，证明在体外野生型p53蛋白可以与IBP启动子序列结合。 (2)结合p53激活剂阿霉素刺激，利用染色质免疫共沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)，在MCF-7和HCT116p53+/+细胞内证明p53可以和IBP启动子区域结合。 4.DNA损伤药物以p53依赖的方式调节IBP的表达 (1)利用WesternBlot在野生型p53表达乳腺癌细胞株MCF-7和ZR-75-1中证明DNA损伤药物顺铂、阿霉素以剂量、时间依赖的方式抑制IBP的表达。 (2)在HCT116p53-/-和p53表达抑制的MCF-7细胞中，WesternBlot检测发现顺铂不能抑制IBP的表达，说明DNA损伤药物在乳腺癌中以p53依赖的方式抑制IBP的表达。 5.乳腺癌中IBP调节顺铂诱导的细胞凋亡 (1)建立稳定的IBP过表达以及IBP表达抑制的MCF-7细胞株，分别检测顺铂对各细胞的增殖抑制作用，计算半数抑制浓度(50%inhibitingconcentration，IC50)，结果表明IBP可以降低乳腺癌细胞株对顺铂的敏感性。 (2)利用WesternBlot检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-adenosinediphosphateribosepolymerase，PARP)的表达以及流式细胞分析，进一步发现IBP可以抑制顺铂诱导的细胞凋亡。 6.乳腺癌中IBP调节顺铂诱导的细胞凋亡机制的初步研究 (1)运用WesternBlot检测基础情况下IBP过表达及抑制细胞中p53及其下游p21的表达，发现IBP可以抑制p53的表达，进一步在顺铂刺激的情况下发现，IBP过表达细胞顺铂诱导的p53磷酸化水平下降，提示乳腺癌中IBP过表达可能降低p53的水平及应答活性。 (2)进一步检测Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的表达，发现IBP过表达增加Bcl-2的表达而降低Bax的表达，提示IBP调节了Bcl-2家族的表达，在乳腺癌中破坏了p53依赖的凋亡通路，说明IBP与p53信号通路之间存在有反馈调节。 (3)进一步发现IBP过表达细胞中AKT和MDM2蛋白的磷酸化增强，结合AKT抑制剂Ly294002或wortmannin处理后，p53表达量增加，提示IBP在乳腺癌细胞中可能通过AKT调节p53的活性。 (4)运用顺铂的细胞毒性实验，在稳定的IBP表达抑制的MCF-7细胞中，发现抑制p53的表达后可以降低细胞对顺铂的敏感性。而在HCT116p53-/-细胞中IBP表达抑制后仍然可以增强细胞对顺铂的敏感性。进一步在IBP过表达的MCF-7细胞中，AKT抑制剂Ly294002联合使用可以增强细胞对顺铂的敏感性。以上结果说明在乳腺癌细胞中IBP可能部分通过AKT/p53途径影响细胞对顺铂的药物敏感性。 综上所述，本研究对人IBP基因5′侧翼序列进行了分析，确定了IBP启动子活性区域位于-294~-115，并分析了野生型p53蛋白对IBP启动子活性及其表达水平的抑制作用，明确了p53蛋白作为转录因子与IBP启动子的结合。进一步研究发现，IBP与p53之间存在有一个相互抑制的反馈环，乳腺癌细胞中IBP的高表达会通过AKT/p53途径抑制p53的表达与活性。乳腺癌中DNA损伤药物可以以p53依赖的方式抑制IBP的表达，而IBP的高表达又可以抑制顺铂诱导的细胞凋亡，其机制与p53表达水平及活性的降低以及Bcl-2家族蛋白表达失调等相关。本研究结果为阐明IBP基因转录调控机制以及进一步深入研究IBP在乳腺癌中表达的临床意义奠定了基础。

硅胶基质是应用最为广泛的高效液相色谱(HPLC)用基质材料。硅胶基质和键合相的化学稳定性决定了其是否能在更宽的pH范围内使用。表面化学修饰是使硅胶基质实现表面功能化的重要步骤。针对以上方面,本论文做了以下研究： 1.以1,4-双(三乙氧基硅基)苯(BTEB)与硅酸乙酯(TEOS)为混合硅源,LDK378,通过溶胶-凝胶法合成了苯基桥联有机无机杂化硅胶(PHS)微球。采用水热处理法,先后以十二胺/N,N-二甲基癸胺,三羟甲基胺基甲烷为扩孔剂对材料进行了扩孔。系统考察了水热处理过程中温度、扩孔剂浓度对材料孔结构的影响。在相同的条件下,以不同比例的BTEB与TEOS(分别为1：4、1：2、1：1、2：1)为硅源合成了四种具有不同苯基桥单元含量的PHS(PHS1/4、PHS1/2、PHS1/1、PHS2/1)。将其填充入色谱柱管后,评价了PHS在高pH(pH=11.0)条件下的稳定性。结果表明,随着PHS中苯基桥单元含量的增加,其碱性稳定性有所增强。 2.分别以上述四种PHS为基质,用十八烷基三氯硅烷通过硅烷化反应键合,OTX015,制备了C18反相固定相。评价说明C18键合PHS固定相表现出与C18键合纯硅胶固定相相似的疏水保留特性。以PHS2/1为基质的C18反相固定相表现出良好的碱性稳定性。该色谱柱在pH11.0条件下持续使用100多个小时,没有出现任何性能(塔板数和保留时间)的退化。然而,该固定相在低pH(pH=1.0)条件下仍然不稳定,保留能力会下降,这是因为酸性溶液会使Si-O-Si键溶解断裂造成有机功能基团从硅胶表面流失。 3.通过对杂化硅胶中有机桥单元直接化学修饰,制备了两种同时在低pH和高pH条件下都稳定的反相固定相。PRT062607,具体方法为：(1)通过脱甲基、醚化两步反应修饰1,4-二甲氧基苯基桥联杂化硅胶,得到C-O-R键合型反相固定相。(2)通过硝化、胺化、酰胺化三步反应修饰苯基桥联杂化硅胶,得到C-N(O)-R键合型反相固定相。在酸性和碱性洗脱条件下分析一些解离型化合物,说明了这两种填料的化学稳定性得到改善的益处。 4.利用Cu(Ⅰ)催化的叠氮-炔基Husigen环加成“点击”化学反应,制备了一系列以S-1,1’-联萘为手性选择器,以三氮唑环为连接臂的手性固定相(CSP)。这些CSP对多种联萘酚衍生物和3-苯基吲哚2-酮衍生物表现出良好的手性分离能力。通过与不含三氮唑环连接臂的联萘CSP作对比,发现三氮唑环虽然远离手性单元,但同样在手性识别过程中发挥着重要的作用。

第一部分的研究证明DNA复制压力能够诱发MN-γ-H2AX(+),且有多项研究证明ROS能够导致不同形式的DNA损伤,因此我们接下来研究了ROS水平与MN-γ-H2AX(+)形成之间的关系。我们使用药物影响ROS水平以及使用具有抗氧化基因缺陷的细胞进行实验,检测MN-γ-H2AX(+)的发生频率；同时使用具有抗氧化作用的药物对以上细胞进行联合处理,Brefeldin A,以抑制细胞内ROS水平的增高,分析ROS与MN-γ-H2AX(+)形成的关系。 1.使用导致ROS水平增高的药物过氧化氢(H202)以及具有抗氧化作用的药物N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理细胞,结果如下： 1)使用不同浓度的H2O2(50μM,100μM,150μM)处理U20S细胞不同时间(2h,6h,12h,24h),随后更换为新鲜完全培养基释放48h,检测MN-γ-H2AX(+)的形成情况。结果显示,H202能够诱发MN-γ-H2AX(+),且呈剂量依赖性和时间依赖性。 2)使用具有抗氧化作用的药物NAC与H202联合处理细胞,结果发现,NAC能够下调H202所造成的MN-γ-H2AX(+)发生频率的增高。从而通过药物实验证明了ROS能够诱发MN-γ-H2AX(+)。 2.通过不同方式使具有抗氧化作用的基因p53功能改变后,ONX-0914,检测MN-γ-H2AX(+)发生频率的变化情况。结果如下： 1)使用p53激活剂nutlin-3处理U20S细胞,MN-γ-H2AX(+)的发生频率有所降低。 2)使用p53抑制剂pifithrin-α处理U20S细胞,MN-γ-H2AX(+)的发生频率有明显增高。 3)使用p53功能缺陷的U20S细胞以及p53缺失的小鼠皮肤成纤维细胞进行实验,结果发现：与对照细胞相比,p53功能缺陷的细胞中,MN-γ-H2AX(+)的发生频率有明显增高。 4)使用具有抗氧化作用的药物NAC处理p53功能缺陷细胞及其对照细胞,结果发现：NAC能够下调由于p53功能缺陷而导致的MN-γ-H2AX(+)发生频率的增高。 3.为了了解p53下游基因对MN-γ-H2AX(+)形成的影响,我们使用siRNA抑制p53下游具有抗氧化作用的基因SESNl的表达。结果发现,与对照细胞相比,SESN1低表达的细胞中,I-BET-762,MN-γ-H2AX(+)的发生频率有所增高。 4.有文献报道p400受到抑制后,细胞内ROS水平有所增高。因此,我们使用p400低表达的U20S细胞进行实验,结果发现p400表达量降低后,MN-γ-H2AX(+)的发生频率明显增高。进一步证明了ROS能够诱发MN-γ-H2AX(+)。 综上所述,ROS水平增高能够诱发MN-γ-H2AX(+)。

为了明确MN-γ-H2AX(+)这类新型微核发生的普遍性,我们对多种哺乳动物细胞进行免疫荧光实验,并选择了人类乳腺癌细胞系MCF-7进行进一步的研究。通过使用药物阻止DNA复制或使用具有DNA复制遗传缺陷的细胞进行实验,我们分析了DNA复制压力与这类新型微核形成的关系。实验结果如下： 1.通过对多种哺乳动物细胞进行免疫荧光实验和微核计数,结果发现： 1)微核分为MN-γ-H2AX(+)和MN-γ-H2AX(-)。4-Methylumbelliferone,MN-γ-H2AX(+)的特征为：微核中显示出均匀弥散的γ-H2AX染色,并且这种弥散性的γ-H2AX染色几乎占据了整个微核。 2)MN-γ-H2AX(+)的存在具有普遍性。不同细胞中MN-γ-H2AX(+)的发生频率有所不同,大约在0.5%到4%之间,占总微核的比例数在20%-50%之间。 2.使用药物处理MCF-7细胞,统计MN-γ-H2AX(+)的发生频率,结果如下：1)使用流式细胞术检测细胞周期分布情况。结果显示,未经药物处理组的S期细胞比例数为30%左右,而羟基脲、胸苷嘧啶、阿非迪霉素处理组的S期细胞比例数增至60%左右,说明药物处理使细胞停滞于S期。 2)使用导致S期停滞的药物羟基脲、阿非迪霉素、胸苷嘧啶处理MCF-7细胞,TAK-875,微核计数结果显示MN-γ-H2AX(+)发生频率的增加幅度远大于MN-γ-H2AX(-)发生频率的增加幅度。 3)紫杉醇通过抑制微管解聚使细胞停滞于有丝分裂中期,使用紫杉醇处理MCF-7细胞,产生的主要是MN-γ-H2AX(-),而MN-γ-H2AX(+)的发生频率并没有明显改变。 3.使用不同药物(阿非迪霉素、羟基脲、胸苷嘧啶、紫杉醇)处理MCF-7细胞24h后,更换为新鲜完全培养基释放不同时间(0h,6h,24h,48h,72h,96h),微核计数结果显示： 1)药物处理后未经释放的细胞中,MN-γ-H2AX(+)的发生频率已有明显增高；药物处理后分别进行6h.24h.48h.72h释放的细胞中,MN-γ-H2AX(+)的发生频率均高于未经药物处理的对照组细胞；药物处理后进行96h释放的细胞中,MN-γ-H2AX(+)的发生频率几乎恢复到本底水平。 2)根据药物处理后,细胞核中γ-H2AX染色的情况将细胞分为三类：对于整个细胞核均呈现出均匀弥散性γ-H2AX染色的细胞,我们将其定义为一类细胞；对于细胞核中存在大量γ-H2AX焦点的细胞,我们将其定义为二类细胞；APO866,对于细胞核中几乎没有γ-H2AX信号的细胞,我们将其定义为三类细胞。结合各类细胞占总细胞的比例以及细胞周期结果推测,药物处理后所检测到的一类细胞与二类细胞很有可能是处于S期且经历DNA复制压力的细胞。药物处理后对不同释放时间各类细胞产生的微核数进行统计,结果发现,使用阻止DNA复制的药物处理后,未经释放的情况下,大多数新产生的MN-γ-H2AX(+)都是由处于S期的一类细胞与二类细胞产生的。由此明确了MN-γ-H2AX(+)是在S期形成的。 4.免疫荧光实验观察小鼠皮肤成纤维细胞(MSF)发现有γ-H2AX信号在细胞核外周聚集成簇并且有向外突出的趋势,推测这样的细胞核突出部位很可能是MN-γ-H2AX(+)的前体。 5.使用具有DNA复制遗传缺陷的细胞进行实验,结果发现： 1)通过流式细胞术和BrdU掺入实验证明,在RPA1低表达的MCF-7细胞中存在DNA复制压力。 2)通过微核计数发现,与对照细胞相比,RPA1(?)(?)表达细胞中MN-γ-H2AX(+)的发生频率有所增高。 综上所述,MN-γ-H2AX(+)是一种新型微核,它不同于传统意义上有丝分裂后期形成的微核,主要是在细胞分裂间期形成的。我们推测这类微核的形成原因是细胞在S期遭遇DNA复制压力,进而导致了大量的DNA双链断裂损伤,这些无法修复的损伤部位聚集在一起排出细胞主核,形成MN-γ-H2AX(+)。研究这类新型的MN-γ-H2AX(+)有助于我们认识DNA复制压力所引起的基因组不稳定性,以及评估导致DNA复制压力的遗传和环境因素。